Гуминовые кислоты различного генезиса : Выделение и исследование стабильных электрофоретических фракций

• Автор: Трубецкой, Олег Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.27
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 237 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ б

ГЛАВА I. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА И ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ

СТРУКТУРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГУМУСОВЫХ ВЕЩЕСТВ

1. Основные варианты электрофоретических методов, применяемых для фракционирования

гумусовых веществ

а. Электрофорез в растворе, на бумаге,

целлюлозе и агарагаре

б . Электрофорез в полиакриламидном геле .

в. Изотахофорез и изоэлектрическое фокусирование

г. Капиллярный электрофорез и капиллярный изотахофорез

2. Принципы и проблемы эксклюзивной

хроматографии гумусовых веществ .
а. Эксклюзивная хроматография при низком давлении
б. Высокоэффективная жидкостная
эксклюзивная хроматография
в. Проблемы эксклюзивной хроматографии
гумусовых веществ
ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 4
1. Характеристика почв
а . Дерновоползолистая почва .
б. Серая лесная почва
в . Чернозм
г . Краснозм .
3. Определение элементного состава, содержания
золы и влажности препаратов гуминовых кислот
4. Электрофорез гуминовых кислот в полиакриламидном
геле в присутствии дезагрегирующих агентов
5. Эксклюзивная хроматография гуминовых кислот на сефадексе С
6. Определение спектров поглощения, коэффициентов экстинкции и цветности
препаратов гуминовых кислот
7. Анализ структурных компонентов гуминовых кислот с помощью пиролитической газовой хроматографиимассспектрометрии в
присутствии тетраметиламмония
8. Определение аминокислотного состава
гуминовых кислот .
9. Ультрафильтрация гуминовых кислот .
. Реактивы, использованные в работе
2. Экстракция и очистка гуминовых кислот
ГЛАВА III. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ГУМИНОБЫХ КИСЛОТ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ В ПРИСУТСТВИИ
ДЕЗАГРЕГИРУЮЩИХ АГЕНТОВ
ГЛАВА IV. СОЧЕТАНИЕ ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ ДЛЯ ПРЕПАРАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИИ ГУМИНОВЫХ
КИСЛОТ
1. Выбор оптимальных условий эксклюзивной хроматографии на сефадексе для получения электрофоретических фракций гуминовых кислот
2. Применение сочетания эксклюзивной хроматографии с электрофорезом для препаративной наработки электрофоретических фракций почвенных гуминовых кислот различного генезиса .
ГЛАВА V. КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОЧВЕННЫХ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ ФРАКЦИЙ,
ПОЛУЧЕННЫХ СОЧЕТАНИЕМ ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ
1. Спектрофотометрическое исследование .
2. Пиролитическая газовая хроматографиямассспектрометрия
а. Идентификация структурных
компонентов .
б. Оценка происхождения исследуемых
препаратов .
3. Аминокислотный состав
ГЛАВА VI. ВЗАИМОСВЯЗЬ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ с ГЕНЕЗИСОМ ПОЧВ
ГЛАВА VII. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СОЧЕТАНИЯ ЭКСКЛЮЗИВНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОЦЕССОВ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ И
КОМПОСТИРОВАНИЯ
1. Анализ эффективности фракционирования почвенных гуминовых кислот методом
ультрафильтрации
2. Мониторинг созревания гуминоподобных веществ в процессе компостирования
органических отходов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ


Кононова и Титова, Титова, Поспишил, Вильк, . Вариации в электродного буфера и концентрации геля, а также использование дискэлектрофореза в некоторой степени улучшало разрешение, но не приводило к получению узких, четко воспроизводимых полос зон на геле. Клокинг i, обнаружила, что с введением анионного детергента додецилсульфата натрия ДДС в электродный буфер при фракционировании ГВ появляется дополнительная узкая полоса. Она объяснила этот эффект разрушением межмолекулярных агрегатов ГВ в присутствии ДДС, однако механизм взаимодействия ГВ и ДДС до сих пор до конца не изучен. Кастагнола с соавт. ГВ в ПАГ мочевину в качестве агента, разрушающего межмолекулярные агрегаты за счет предотвращения образования водородных связей. В отсутствии мочевины для восьми препаратов ГК, выделенных из почвенных образцов двумя различными методами экстракция 0. V или 0. ГК задерживалась 3 ПАГ, образуя фракцию А, другая большая часть вещества, задерживалась на границе между 3 и ПАГ, одна достаточно узкая полоса проникала в гель и формировала фракцию С. Добавление в буфер геля М мочевины сопровождалось уменьшением интенсивности фракции В с одновременным увеличением интенсивности фракции . С и появлением дополнительных узких фракций и Е с большей электрофоретической подвижностью по сравнению с подвижностью фракции С. На основании данных экспериментов авторы сделали вывод о существовании межмолекулярных агрегатов ГК, стабилизированных водородными связями, при разрушении которых происходило образование новых фракций с более высокой электрофоретической подвижностью. Для характеристики электрофоретических фракций Кастагнола с соавт. Удалось показать, что высокомолекулярные фракции А и В, не входящие соответственно в 3 и ПАГ, окрашивались фуксином, что указывало на присутствие в них полисахаридов, в то время как низкомолекулярная фракция С эпгим красителем не окрашивалась. Фракции и Е, образующиеся по мнению авторов из высокомолекулярной фракции В при добавлении мочевины, не окрашавались фуксином, а следовательно не содержали полисахаридов. Однако следует отметить, что красители альциановый голубой i и астра голубой , реагирующие с кислыми полисахаридами, окрашивали все визуально наблюдаемые естественно окрашенные фракции А, В, С, и Е. При помощи окрашивания полиакриламидного геля красителем синильным голубым i было показано, что фракция С обладала способностью восстанавливать до 2. Авторы предположили, что фракция С содержит орто или парадифенолы. Специфические к белкам красители амидовый черный i и кумасси яркий голубой i ii не окрашивали ни одну из фракций ГК на электроферограмме, хотя наличие 0. ГВ различного происхождения неоднократно подтверждено экспериментально см. V, раздел 3 настоящей диссертации. ГВ красителями различной специфичности является то, что ни один из них не выявил на геле какойлибо дополнительной полосы ГК, за исключением естественно окрашенных, видимых глазом коричневых зон фракций. Несмотря на исключительную важность и принципиально новые данные, полученные в серии работ этих авторов, следует отметить, что их результаты не всегда воспроизводимы и сопоставимы между собой. Это, повидимому, явилось одной из причин того, что попытки авторов обнаружить корреляцию между двумя методами фракционирования ГК электрофорезом и эксклюзивной хроматографией не увенчались успехом . С помощью электрофореза в ПАТ Каспаровым с соавт. Для фракционирования ГК и ФК был использован дискэлектрофорез т. ПАГ. Пять сравнительно дискретных зон в геле и одна дополнительная фракция на границе между сефадексом и ПАГ были получены для двух препаратов ГК, выделенных из различных по генезису почв. Молекулярная масса ММ для электрофоретических фракций была подсчитана, исходя из допущения, что молекулы ГК имеют сферическую форму, а метод, используемый для перевода молекулярных размеров белков в молекулярные массы может быть непосредственно применен для ГК. На основании определенного диаметра молекул отдельных фракций ГК от 2 до нм были вычислены их молекулярные массы от 2XI до 1.