Гибриды клеток эмбриональной карциномы мыши линии PCC4aza1 и их свойства, проявляемые при культивировании in vitro

• Автор: Шрамова, Елена Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

1 Обзор литературы

Введение.

1.1 Рспрограммирование соматических ядер при переносе в энуклеированные

ооциты или зародыши млекопитающих.

1.1.1 Изменения в уровне метилирования ДНК после трансплантации ядер.

1.1.2 Импринтированные гены при переносе ядер в ооциты млекопитающих .

1.1.3 Модификации хроматина, наблюдаемые при трансплантации ядер

1.1.4 Реактивация неактивной Ххромосомы донорских ядер женских особей при трансплантации.
1.1.5 Изменения длин теломер и активность теломераз в процессе переноса дифференцированных ядер в энуклеированные ооциты .
1.2 Репрограммирование соматических ядер в гибридных клетках.
1.2.1 Репрограммирование ядер в гибридах эмбриональных зародышевых и соматических клеток.
1.2.2 Гибриды эмбриональных стволовых и соматических клеток как инструмент для исследования репрограммироваиия соматических ядер.
1.2.3 Исследование гибридов клеток эмбриональной карциномы и соматических клеток.
1.3 Альтернативные методы репрограммирования ядер соматических клеток
Заключение.
Цель и задачи работы
2 Материалы и методы
2.1 Химические реагенты.
2.2 Используемое оборудование
2.3 Работа с культурами клеток
2.3.1 Размораживание клеток
2.3.2 Культивирование клеток.
2.3.3 Криоконсервация клеток.
2.4 Работа с лимфоцитами селезенки мыши.
2.4.1 Выделение лимфоцитов селезенки мыши.
2.4.2 Культивирование лимфоцитов
2.5 Обработка клеток ингибиторами клеточной пролиферации
2.6 Получение клеток с инактивированной митохондриальной ДНК с помощью родамина 6.
2.7 Эксперименты по слиянию клеток
2.7.1 Слияние клеток с помощью ПЭГ.
2.7.2 Слияние клеток с помощью электрошока.
2.8 Дифференцировка клеток i vi.
2.9 Цитофлуоромстрический анализ
2. Приготовление и изучение хромосомных препаратов.
21 Получение метафазных пластинок хромосом .
22 Выявление активных ядрышкообразующих районов хромосом с помощью .
23 Проведение флуоресцентной гибридизации i i
2. Молекулярнобиологические исследования
21 Работа с ДНК.
22 Работа с РНК . 5
23 Полимеразная цепная реакция.
24 Электрофорез в агарозном геле.
3 Результаты
3.1 Получение гибридных клеток с репликативно инактивированным генетическим материалом одного из партнеров по слиянию.
3.2 Изучение свойств клеток эмбриональной карциномы мыши РСС4ага1 при гибридизации с клетками иного тканевого происхождения
4 Обсуждение
Выводы
Приложение А Состав культуральных сред, растворов и буферов
Список литературы


Клетки ЭК относятся к опухолеобразующим стволовым клеткам, обладающим значительным сходством с клетками ранних эмбрионов i, . Они способны к образованию тератокарцином у изогенных животных, включаются в различные ткани взрослого организма при инъекции в бластоцисты i viv i, I, и в присутствии индукторов способны дифференцироваться в эмбриоидные тела, нейрональные клетки, мышечные клетки или кардиомиоциты в системе i vi i . Однако в отличие от ЭС, клетки ЭК не требуют специальных, часто сложных, условий культивирования и потому более доступны для получения межклеточных гибридов и изучения их свойств. В литературе имеются данные, что при репрограммировании соматического ядра в составе гибрида с ЭС клеткой наиболее важны белковые факторы, содержащиеся в ядре плюрипотентной клетки, поскольку цитонласты илюрипотентных клеток не способны репрограммировать соматические ядра , , . Однако наличие в гибридах генетического материала обоих партнров по слиянию препятствует медицинскому использованию таких клеток в заместительной терапии. Поэтому до сих пор актуальной остается разработка подходов к инактивации или элиминации генома плюрипотентной клетки, не затрагивающих ее способности репрограммировать ядра соматических клеток и способности к дифференцировке. Цель настоящей работы заключалась в изучении основных свойств гибридов клеток эмбриональной карциномы мыши 4 и клеток мыши иного тканевого происхождения. В работе предложен подход для получения диплоидных гибридов между клетками 4 и эмбриональной тератокарциномы линии Р путем репликативной инактивации генетического материала клеток Р с помощью ДНКсшивающего агента митомицина С. Кроме этого, в настоящей работе впервые получены и охарактеризованы стабильные тетраплоидные гибриды между клетками 4 и пролиферирующими и обработанными 5азацитидииом клетками селезенки взрослой мыши. Полученные данные позволяют сделать вывод об изменении состояния исходных клеток 4 и лимфоцитов селезенки после слияния, о чем можно судить по изменению пролиферативной активности гибридов по отношению к исходным клеткам и изменению картины экспрессии соматических генов лимфоцитов под действием факторов клеток ЭК. В работе изучено состояние ядрышкообразующих районов хромосом ЯОР в гибридах, как ранее неизученного маркера ренрограммирования ядер. Показано, что изменение активности рибосомных генов отражает зависимость свойств гибридных клеток от условий культивирования и может регулироваться двумя способами путем инактивации ЯОР в неселективных условиях культивирования или путем удаления ЯОхромосом в селективных условиях культивирования. Термин репрограммирование появился в е годы прошлого века, когда Гордон показал возможность клонирования амфибий путем переноса ядер эндодермальных клеток кишечника головастика в активированные энуклеированные яйцеклетки Сигс1оп, . Репрограммирование можно определить, как функциональную реверсию генетического материала ядра дифференцированной соматической клетки к состоянию плюрипотентности, т. После опытов Грдона прошли годы, прежде чем удалось получить первое клонированное млекопитающее овечку Долли Пиш1 еЬ а Долли была получена методом переноса ядра соматической клетки взрослой овцы в энуклеированный ооцит. До этого удавалось получать клонированных млекопитающих лишь при использовании ядер эмбриональных клеток. Поэтому работа Вилмута стимулировала изучение процессов репрограммирования ядер соматических клеток млекопитающих и их способности к дедифференцировке. В настоящий момент признаки репрограммирования соматического ядра описаны в работах, посвященных изучению процессов 1 переноса ядер в энуклеированные ооциты или зародыши 2 гибридизации слияния соматических и плюрипотентных или мультипотентных клеток 3 инкубации клеток с экстрактами ооцитов или плюрииотентных клеток 4 введения генов, вызывающих репрограммирование соматических клеток. Процесс рспрограммирования регулируется эпигенетическими механизмами и не требует изменения последовательности геномной ДНК.