Роль конденсина в стабилизации ядрышкового организатора в процессе митотического деления у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Бутылин, Павел Андреевич
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 95 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Актуальность проблемы.

1.2 Цели и залами.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Белки семейства.

2.2 Коидснсин

2.2.1 Кондеисип структура.

2.2.2 Кондеисип локализация в клетке, связывание с ДНК

2.2.3 Конденсип функции комнактизация.
2.2.4 Конденсип функции сегрегация хроматид.
2.2.5 Конденсип функции регуляция клеточного цикла
2.2.6 Конденсип функции регуляция транскрипции
2.3 рДНК, ядрышко, ядрьпиковый организатор.
2.4 Регуляция биосинтеза рибосом , рапамицин.
2.5 Штаммы с измененной рибосомнои ДНК.
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Штаммы.
3.2 Плазмиды.
3.3 Среды н условия культивирования
3.4 Молекулярнобиологические и биохимические методы.
3.5 Тест на стабильность хромосомы III.
3.6 Минихромосомы
3.7 Тест на потерю минихромосом
3.8 Микроскопия
3.9 Микроскопия живых клеток в реальном времени
ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ
5.1 Значение ядрышкового организатора в контроле продолжительности и динамики анафазы дрожжей.
5.1.1 Штаммы с зписомной рДНК имеют высокий уровень генетической нестабильности
5.1.2 Отсутствие хромосомного локуса рДНК повышает уровень успешной сегрегации ядрышка в мутантах
5.1.3 Возможный механизм нестабильности генома в штамме с ЭрДНК повышенная чувствительность к функциональности митотического веретена и кннетохора
1.4.1 Анализ динамики митоза телофазаанафаза в штаммах с различной структурой рДНК.
5.2 Функциональное и физическое взаимодействие кондснсина с ДНК ядрышкового организатора
5.2.1 Активность I необходима для выхода кондснсина из ядрышка по окончании митоза
5.2.2 Транскрипционный статус рДНК связан с повышением частоты ошибок сегрегации ядрышка при активации мутации конденсина.
5.2.3 Стабильность минихромосомы, содержащей мономер рДНК, зависит от функционального состояния рДНК активности 1 и мутации кондснсина
5.2.4 Транскрипция РНКиолимеразой II не оказывает дестабилизирующего действия на мниихромосому, содержащую рДНК.
2.5 Исследование митотической стабильности минихромосом, содержащих двойной
повтор рДНК.
5.3 Определение стабильности минихромосом, содержащих последовательности
связывания конденсина i i.
ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ.
6.1 Транскирипция I и связывание конденсина на рДНК.
6.2 Роль рДНК в процессе регуляции точности расхождения хромосом в митозе
6.3 Скрининг индивидуальных сайтов связывания конденсина в геноме . vii с использованием модели митотической ещрегации минихромосом.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Кондеисип структура. Конденсип функции комнактизация. Конденсип функции сегрегация хроматид. ДНК, ядрышко, ядрьпиковый организатор. Регуляция биосинтеза рибосом , рапамицин. Штаммы с измененной рибосомнои ДНК. ГЛАВА 3. Штаммы. Плазмиды. Молекулярнобиологические и биохимические методы. Тест на стабильность хромосомы III. ГЛАВА 5. Значение ядрышкового организатора в контроле продолжительности и динамики анафазы дрожжей. Анализ динамики митоза телофазаанафаза в штаммах с различной структурой рДНК. Транскрипционный статус рДНК связан с повышением частоты ошибок сегрегации ядрышка при активации мутации конденсина. Транскрипция РНКиолимеразой II не оказывает дестабилизирующего действия на мниихромосому, содержащую рДНК. ДНК. ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ. Транскирипция I и связывание конденсина на рДНК. Скрининг индивидуальных сайтов связывания конденсина в геноме . ВЫВОДЫ. ГЛАВА 1. Стабильность генома и передача генетического материала из поколения в поколение гарантируется точностью расхождения хромосом в митозе. Сегрегация хромосом в процессе клеточного деления требует от эукариотической клетки слаженной работы комплекса ассоциированных с хроматином структурных белков и энзимов. Один из этих белковых факторов это конденсин, молекулярная машина конденсации хромосом , i, . У позвоночных обнаружены два конденсиновых комплекса конденсин I и конденсин II, различающиеся динамикой экспрессии и картиной хромосомной локализации i, . У пекарских дрожжей vii выявлен только один конденсин, состоящий из пяти жизненно важных субъединиц, две из которых 2 и 4 относятся к белкам i , и содержат участок связывания АТФ, а три это вспомогательные субъединицы Вгп1, 4 и 5. Все компоненты комплекса высококонсервативные белки. Мутации хотя бы одной из субъединиц приводят к нарушению разделения хроматина при делении клетки . Сходные фенотипы нерасхождения хроматид в митозе при инактивации конденсина описаны и у высших эукариот . Основной функцией конденсина i viv является не столько компактизация хроматина, сколько разделение хроматид в ходе митотической сегрегации. Xi . У позвоночных конденсины, диффузно распределнные в цитоплазме конденсин I или в ядре конденсин II в интерфазе, в митозе перераспределяются во внутренние домены конденсированных хромосом , i, i . У . ДНК . Рибосомная ДНК рДНК . XII хромосомы. Каждый повтор рибосомной ДНК содержит ген предшественник рРНК,
транскрибируемый РНК полимеразой первого типа I, а также ген, транскрибируемый РНК полимеразой третьего типа III, кодирующий 5 рРНК . Эти гены разделены двумя нетраскрибируемыми спейсерными участками рис. А. Ранее было показано, что конденсин имеет 4 главных сайта связывания на рибосомной ДНК, два из которых приходятся на участок, транскрибируемый I. Около половины повторов рДНК являются транскрипционно активными, при этом число генов рДНК остается стабильным из поколения в поколение . РНК у клеток, находящихся в разных фазах роста . Роль молчащих повторов рДНК остатся неизвестной. Инактивация конденсина в клетках Б. Дефекты
сегрегации наиболее ярко выражены для хромосомы XII, несущей гены ядрышкового организатора. Частота нерасхождений этой хромосомы в раза выше, чем других хромосом УопдОопга1ег е а1. Какие особенности организации и функционирования ядрышка обуславливают тот факт, что сегрегация именно этого локуса является особенно зависимой от конденсина Этот вопрос, а также вопрос о молекулярной природе взаимодействия конденсина и района ядрышкового организатора, являются предметом настоящей работы. Высокая пластичность дрожжевого генома предоставляет возможность исследовать анатомию взаимодействия конденсина и субдоменов рДНК. Для исследования функционального взаимодействия хроматина ядрышка с конденсином в митозе мы использовали штамм с эписомной локализацией рДНК, в котором хромосомный локус рДНК тандемные повторы был заменн многокопийной плазмидой, несущей одиночные повторы рДНК Vi е а1м . Использование данной модели позволило впервые показать роль ядрышка в регуляции процесса сегрегации всего генома в митозе.