Роль белков р53 и р73 в ответе опухолевых клеток на действие ДНК-повреждающих агентов

• Автор: Виханская, Фаина Львовна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 152 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Белок р, открытие, структура и его мутации и опухолях

2.2. Функции р в регуляции клеточно1,о цикла в нормальных условиях и после действия ДНКповреждаюших агентов. Роль р в апоптозе и репарации ДНК.

2.3. Участие р в ответе опухолевых клеток на действие противоопухолевых препаратов.

2.4. Белок р, открытие, структура, р сплайсинговые изоформы, экспрессия в опухолях.

2.5. Функции р, как транскрипционного активатора Специфические

транскрипционные активности сплайсинговых вариантов р, взаимодействие с р и другими клеточными белками. Роль р в развитии и туморогенезе на моделях мышей с нокаутом по гену Участие р в ответе опухолевых клеток на противоопухолевые препараты.
2.6. Роль изоформ ра и р в определении чувствительности клеток к противоопухолевым препаратам.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Клеточные линии и их культивирование

3.2. Обработка клеток ДНКповреждающими агентами
3.3. Плазмиды, трансфекции, селекция клонов и популяций клонов
3.4. Оценка цитотоксического эффекта по методу МТТ
3.5.Оценка цитотоксичности по критерию клоногенности
3.6. Определение апоптоза с использованием Аннексина V
3.7. Нозерн и Саузерн блоттинг
3.8. ОТПЦР
3.9. Определение экспрессии генов микроэррэй анализом
3 Определение белка с использованием иммуноблотинга. Антитела, используемые в работе
3Определение промоторной активности с использованием
люциферазного метода и метода ацетилирования хлорамфеникола С .
3 ОТПЦР в реальном времени i
3. Ядсрные экстракты и гельретардация
3 Определение репарационной способности клеток с использованием метода реактивации поврежденной плазмиды клеткой хозяина
3 Иммунофлуоресценцня. Иммуногистохимический анализ
экспрессии генов.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Р и контроль клеточного цикла
4.1.1. Создание модели, экспрессирующей температурочувствигельный
р. р вызывает блок С2 клеточного цикла
4.1.2. Транскрипция генарЛт1 может регулироваться по р независимому пути
4.1.3. Р подавляет транскрипцию промотора гена Топоизомеразы 2а
4.1.4. Р и ответ клеток на действие противоопухолевых препаратов
4.1.4.1. Роль р в ответе на обработку доксорубицином
4.1.4.2. Р и действие таксола
4.1.4.3. Р и ответ на обработку цисплатиной
4.1.4.4. РгоЛ р полиморфизм в сочетании с горячими толковыми мутациями в ДНКсвязывающсм домене и чувствительность к ДНКповреждающим агентам
4.2. Р второй член семейства р
4.2.1. Взаимодействие р и р
4.2.2. Р и гены репарации ДНК
4.2.3. и ангиогенез
4.2.3.1. Р и регуляция 1 и V
4.2.3.2. Р и васкуляризация опухолей i viv
4.2.4.Регуляция р после действия ДНКповреждающих агентов
4.2.4.1. Индукция р РНК и белка
4.2.4.2. Индукция активности промотора после обработки 3 доксорубицином
4.2.4.3. Участие транскрипционного фактора СЕВРа в индукции 4 промотора р
4.2.5. Ра гипсрэкспрессия в клетках опухолей яичников и 8 чувствительность к обработкам ДНКиовреждающими агентами
4.2.6. Изоформа и ее роль в ответе опухолевых клеток при 1 действии противоопухолевых препаратов
5. ОБСУЖДЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Со времени первых исследований наши знания об активации р значительно расширились, и стало понятно, что р может активироваться самыми разнообразными типами стресса В i. ДНК . Структура генар довольна хорошо изучена. Схема представлена на рисунке. Рис. Область связывания с семейством ВО. Рис. Структура гена р. В области конца расположен трансактивирующий домен и пролинобогащенная область, которая служит для активации программы аноптоза. В области конца находятся последовательности для взаимодействия с транскрипционной системой и с МДМ2. Центральный домен содержит област ь связывания с ДНК, где, в основном, располагаются мутации, появляющиеся в процессе развития опухолей. В центральной части находятся места связывания с белками семейства 2. Сконцсвая область содержит олигомеризационный домен, и сигналы ядерной локализации, а также сигналы экспорта. В концевой части р может быть фосфорилирован, С концевая часть содержит области модификации, влияющие на стабильность, локализацию протеина и активность р. Функции р при развитии опухолей могут быть потеряны в результате различного вида мутаций. Р мутирован в опухолей. В основном это точечные мутации . Интересно, что некоторые кодоны р имеют особенно высокую способность к мутациям. Это кодоны 5, 5, 8. ДНК. ДНК контактными мутациями, 5, 5, 9 и 2 являются конформационными мутациями , . Мутации в области ДНКсвязывающего домена препятствуют связыванию р с рспецифическими регуляторными последовательностями V , . Па рис. Рис. Распределение горячих мугаций по гену р адаптировано из обзора . По оси ординат количество мутаций , по оси абсцисс номера кодонов. В результате приобретенных мутаций р становится более стабильным,по сравнению с диким типом. Мутантный р может инактивировать дикий р по доминантнонегативному способу. Инактивация может быть неполной и зависит от типа мутаций. Но даже в случае частичной инактивации дикого р это дает селективное преимущество во время развития опухолей. Все больше появляется данных о том, что мутантный р не только теряет свойства подавлять развитие опухолей, но и приобретает новые проонкогенные свойства, стимулирующие рост i , . Новые функции мутантного р имеют свой определенный термин iii. Мутантный р
может активировать ряд генов, участвующих в ускоренной пролиферации клеток, таких как стус i . Помимо этого, мутантный может подавлять экспрессию геновмишеней р i , 2, , Vi , . В самое последнее время на моделях клеток мыши было показано в прямых экспериментах, что восстановление нормального р в опухолях, несущих мутантный белок, приводит к их регрессии X , V , . Функции в регуляции клеточного цикла в нормальных условиях и после действия ДНК повреждающих агентов, в апоптозе и репарации ДНК. Рсвязывающиеся белки. В году Дэвид Лэйн , , которому принадлежала честь одним из первых открыть р, дал белку крылатое 3i 3 определение включает в себя способность р регулировать клеточный цикл и запускать программу апоптоза. В то время казалось, что в принципе основные функции р уже описаны. Но за прошедшие годы наши знания о возможностях р и сигнальных путях, ведущих к его активации, значительно расширились. Целый набор факторов, вызывающих активацию р и белков, которые могут участвовать в деятельности р, представлены на Рис. З адаптировано из обзора ii , . Процесс регуляции р может быть в общих словах разделен на фазу идукции сигналов активации, активацию р и результат активации р. Рис. З. Сигнальные пути р. Активация р, белки, которые могут модифицировать р активность, функции р, проявляющиеся при активации. Активация р в ответ на действие ДНКповреждающих агентов. В нормальных условиях количество р в клетке находится на достаточно низком уровне. Для того, чтобы р был способен к биологическому ответу и активации процессов внутри клетки, количество белка р должно увеличиться. В основном это сводится к инактивации 2, который является основным негативным регулятором р. После действия повреждающих агентов р активируется. Эта способность быстро аккумулироваться в поврежденных клетках ставит р в особое положение по сравнению с другими генами. V , , гипоксию i. Накопление в основном проходит на посттранскрипционном уровне i а.