Роль ретропозонов ALU-семейства в регуляции генной экспрессии в клетках линий НЕК293 и А549 человека

• Автор: Усманова, Надежда Маратовна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 151 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

П. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Структура и свбйства ретропознов семейства.

1.1. Строение ретропозонов семейства

1.2. Классификация и амплификация повторов

1.3. Механизм ретропозиции повторов.

1.4. Распределение повторов в геноме человека.

2. Роль повторов в регуляции генной экспрессии

2.1. Регуляция генной экспрессии повторами на уровне транскрипции и процессинга мРНК
2.1.1. Ассоциация повторов с динуклеотидами и островками
2.1.2. Ассоциация повторов с ССГФ
2.1.3. Последствия инсерции повторов v в кодирующую часть генов.
2.1.4. Последствия опосредованной рекомбинации
2.1.5. Ассоциация повторов с простыми повторами.
2.1.6. Роль повторов в аденозининозин дезаминировании
2.2. Регуляция генной экспрессии повторами на уровне трансляции.
2.3. Регуляция генной экспрессии повторами на уровне стабильности мРНК
2.4. повторы и малые интерферирующие РНК миРНК
3. Ангиотензинпревращающий фермент
3.1. Строение ангиотензинпревращающего фермента.
3.2. Локализация, субстраты и функции АПФ.
3.3. Инсерциониоделеционный полиморфизм в гене АПФ.
4. Инактивация X хромосомы
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Обработка базы данных промоторов.
1.1. Описание базы данных промоторов
1.2. Описание программы .
1.3. Описание программы
1.4. Описание базы данных
1.5. Описание программы
2. Клонирование фрагментов промоторов генов II и в экпрессионные плазмиды, содержащие ген люциферазы.
2.1. Выделение ДНК из крови фенольнохлороформным методом.
2.2. Амплификация фрагментов промоторов генов.
2.3. Рестрикция вставки и плазмиды 3i.
2.4. Лигирование вектора и вставки
2.5. Трансформация бактериального штамма .i 5 плазмидной ДНК с применением хлористого кальция
3. Трансфекция клеточных линий рекомбинантными плазмидами и измерение активности люциферазы.
4. Определение I полиморфизма в гене АПФ
5. Определение уровня свободных аминокислот.
6. Обработка последовательности X хромосом человека и мыши
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Создание модельного объекта для изучения функциональной роли повторов в промоторах генов.
2. Дизайн праймеров.
3. Клонирование фрагментов промоторов генов II и в плазмиду 3i.
4. Трансфекция клеток линий НЕК3 и А9 полученными конструкциями и измерение активности люциферазы в клеточных лизатах.
5. Результаты измерения активности люциферазы в лизатах клеток, трансфицированных различными конструкциями
6. В составе го интрона гена АПФ обнаружен ассоциированный цисрегуляторный модуль
7. Шполиморфизм в гене АПФ влияет на уровень фенилаланина и смеси
лейцинизолейцин в плазме крови людей
8. Анализ X хромосом человека и мыши.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Впервые показано, что повторы человека и I повторы мыши могут участвовать в регуляции генной экспрессии на уровне формирования факультативного гетерохроматина в ходе инактивации X хромосомы. Теоретическое и практическое значение работы. Работа вносит определенный вклад в современные представления о механизмах регуляции экспрессии генов. В практическом отношении представляет интерес установленная корреляция между инсерционноделеционным полиморфизмом в гене АПФ и уровнем фенилаланина и смеси лейцинизолейцин в плазме крови людей. Коррекция уровня свободных аминокислот имеет значение при лечении некоторых наследственных заболеваний, в частности, аминоацидопатий. Результаты настоящего исследования могут быть использованы в курсах лекций по клеточной и молекулярной биологии для студентов медицинских и биологических специальностей высших учебных заведений. Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Международной молодежной научнометодической конференции Проблемы молекулярной и клеточной биологии Томск, , Международной конференции Рецепция и внутриклеточная сигнализация Пущино, , Международной конференции II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной летию Института цитологии РАН СанктПетербург, . Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных семинарах лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН. повторы получили свое название благодаря тому, что большинство из них содержит тетрануклеотид 0 п. . Длина консенсусной последовательности повторов составляет 2 н. Отдельные представители семейства имеют различную длину за счет вариабельных областей и вариаций длины, входящих в состав повтора полиадениновых участков. Собственно, повтор представляет собой димер, состоящий из двух прямых повторов длиной 0 н. Правый мономер длиннее левого на п. Богатая аденином последовательность, называемая полиАхвостом, имеется и на Зконце второго мономера. Оба мономера повтора гомологичны друг другу на . В составе всего повтора можно выделить 3 консервативные и 2 вариабельные области. Каждый повтор фланкирован прямыми повторами длиной от 7 до н. Хитринская и др. v . Рис. Схема строения повтора взято из v . Согласно одному из предположений i, , эволюционной предшественницей повторов приматов является 7 РНК, которая представляет собой неотъемлемую часть сигналраспознаюхцей частицы i ii i. Частица взаимодействует с сигнальным пептидом на конце синтезирующихся в ходе трансляции полипептидов, предназначенных для дальнейшей секреции или инсерции в клеточные мембраны, и по окончании процесса транспортирует их к мембране эндоплазматического ретикулума, где взаимодействует со своим рецептором i . В геноме чеолвека имеется 4 гена 7 РНК и несколько сотен исевдогенов i, i, . Предполагается, что вследствие делеции внутренней части последовательности 7 РНК произошли i эволюционно древние элементы, которые в свою очередь дали начало свободным правому и левому мономерам , и . У приматов объединение произошло примерно млн. iii . Левый мономер повторов содержит функционально активный внутренний промотор для РНК полимеразы III, состоящий из двух коротких консервативных элементов. Первый, располагающийся на участке 4 , был назван энхансерным элементом, или xА см. 3 Второй элемент, называемый направляющим элементом, или x расположен на участке и содержит последовательность 53. ВохВ является необходимым и достаточным для относительно точной, хотя и неэффективной инициации транскрипции i vi, тогда как присутствие xА увеличивает эффективность транскрипции в раз , . Таким образом, организация промотора повторов очень похожа, хотя и не идентична организации промоторов генов тРНК.