Функциональная характеристика натриевых каналов в невозбудимых клетках и роль примембранного цитоскелета в их регуляции

• Автор: Негуляев, Юрий Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 172 с. : ил

Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль цитоплазматического натрия в клетках

1.2. Катионные натрийнроводящие каналы в различных типах клеток

1.2.1. Функциональная характеристика и молекулярная топология натриевых каналов семейства ЕаСИ

1.2.1.1. Натриевые каналы эпителиальных тканей.

1.2.1.2. Электроневозбудимые натриевые каналы в клетках различной специализации.

1.2.1.2. Молекулярная организация потенциалнезависимых натриевых каналов семейства ЕИаСИ

1.2.2. Катионные каналы, формируемые белками семейства ТЯР

1.3. Роль цитоскелета в рефляции ионных механизмов клеточной сигнализации

1.3.1. Ионный транспорт

1.3.2. Подвижность и пространственная локализация ионных каналов
1.3.3. Цитоскелет и внутриклеточный кальций
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Регистрация токов через одиночные каналы на изолированных фрагментах клеточных мембран
2.1. Клоксхемы различных модификаций метода патчкламп
2.2. Усилители для регистрации токов через одиночные каналы
2.3. Микроманипуляции с клетками в патчкламп экспериментах
2.4. Камеры
2.5.Стеклянные микропипетки
2.6. Юзе тки
2.7.Растворы
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ЗЛ. Новый тип натрийсслективных каналов в перитонеальных
макрофагах крысы
3.1.1. Эксперименты с нативными клетками
3.1.2. Активность одиночных каналов в экспериментах на
изолированных мембранных фрагментах в режиме оиШ1еоШ
3.1.3. Селективные свойства каналов
3.1.4. Зависимость проводящих свойств 1гаканалов от концентрации проникающего катиона
3.1.5. Действие потенциальных блокаторов натриевых каналов
3.2. Натрийпроводящие каналы в клетках карциномы человека А1
3.3. Функциональные характеристики натриевых каналов в клетках лейкемии человека
3.3.1. Два типа натрийпроводящих каналов в клетках К2
3.3.2. Блокирование кантов амторидом
3.3.3. Альдостерон повышает уровень активности натриевых каналов в тетках К
3.3.4. Повышение уровня свободного внутриклеточного кальция приводит к активации каналов
3.4. Цитоскелетзависимая регуляция натрийпроводящих каналов
3.4.1. Влияние актинового цитоскелета на свойства натриевых каналов в клетках К
3.4.1.1. Разрушение актиновых филаментов в нативных клетках приводит к активации Шканалов
3.4.1.2. Влияние цитохалазина Д на интегральный натриевый ток
3.4.1.3. Каналы, активируемые натяжением плазматической
мембраны, отличаются от каналов активируемых разрушением актинового цитоскелета
3.4.1.4. Актинсвязывающий белок гелъзолин и активация каналов
3.4.1.5. Динамика перестроек подмембранного актина и активность 7 натрийпроводящих каналов
3.4.1.6. Актинсвязывающий белок Сар2 препятствует инактивации 5 натриевых каналов
3.4.2. Функциональная связь между перестройками актинового
цитоскелета и апроводящим и каналами, активация которых регулируется состоянием кальциевых депо в лимфоцитах человека
3.4.2.1.Т1атчкламп эксперименты
3.4.2.2. Анализ изображений модификации актинового цитоскелета 4 мембранных перестроек под воздействием цшпохалазина Д
и каликулина А
3.4.3. Функциональная локализация активных ионных каналов на
поверхности нативных клеток
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ
Список литературы
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Интересно отметить, что увеличения амплитуды катьциевых токов в этих экспериментах не происходило в тех случаях, когда внеклеточный натрий замещатся литием, который способен заменять натрий в ряде клеточных процессов и системах пассивного транспорта натрия. Авторами упомянутых работ было высказано предположение о тоги, что ионы натрия, проникающие в клетку, влияют на цАМФзависимый рщуляторный механизм, шрающий важную роль в поддержании каналов в фосфорилированном состоянии. Хотя уже многие годы известно, что вход натрия через потенциалзависимые каналы приводит к деполяризации клеточной мембраны, только относительно недавно появились данные о том, что натрий может играть дополнительную роль в модуляции проводимости потенциатзависимых Саканалов iv а. ТТХчувствительных электровозбудимых натриевых каналов может оказывать значительное стимулирующее воздействие на кальциевую проводимость, сопряженную с высвобождением глютамата. Оказалось, что строго локализованное увеличение концентрации ионов натрия внутри клетки частично ингибирует транслокацию протеин киназы С, что, вероятно, какимто образом связано с медленной фазой высвобождения медиатора v . Некоторые авторы полагают, что уровень свободного кальция в цитозоле также контролируется натрийзависимыми механизмами. Гак, например, в опытах с хромафинными клетками быка i, Као, концентрацию внутриклеточного натрия увеличивали путем сто загрузки через аиетилхолинрецепторуправляемые ионные каналы или через потснциалзависимыс натриевыеканалы. После этого как в первом, так и во втором случае наблюдали увеличение секреции катехоламинов и концентрации свободного кальция Са2, в цитозоле по сравнению с контрольными клетками, загрузка натрия в которые блокировалась гексаметониумом или тстродотоксином, антагонистами этих каналов. На глад комы шечных клетках аорты крысы было показано, что уровень кальция в клетке может управляться натрийзависимыми механизмами . Удаление натрия из раствора, омывающего клетки, и замещение его холином приводило к увеличению концентрации кальция внутри клетки. Изменения концентрации ионов кальция, вызванные натриевым током, показаны на изолированных вентрикулярных миоцитах морских свинок i, ii, . В работе было высказано предположение о том, что натриевый ток может выполнять роль фактора безопасности в сопряжении возбуждения и сокращения сердечных мыши путем ускорения изменений концентрации кальция, ответственных за передачу сигнала в субсарколемном пространстве. С помощью флуоресцентных измерений на клетках околоушных слюнных желез крысы i . АТФ вызывает временное увеличение внутриклеточной концентрации кальция, когда в наружном раст воре кальций отсутствует. Такой АТФиндуцированный Са2 ответ не наблюдается при удалении экстраклеточного натрия. В работе , vi, показано, что стимуляция мускариновых рецепторов индуцирует мобилизацию ионов магния из внутриклеточных депо, и это увеличение концентрации свободного внутриклеточного магния зависит от концентрации ионов натрия и кальция внутри клетки. Выло показано также, что опустошение магниевых депо опосредовано натрийзависимым ионнотранспортным механизмом, и увеличение Са2, активирует этот механизм не напрямую, а посредством увеличения концентрации внутриклеточного свободного натрия . Авторы высказывают предположение о том, что увеличение концентрации ионов натрия приводит к активации V, локализованного в мембранах внутриклеточных магниевых депо. В наружных мембранах изолированных вентрикулярных миоцитов морских свинок были подробно охарактеризованы натрийактивируемые калиевые каналы i . В опытах i vi было показано, что увеличение уровня натрия в цитозоле активирует транскрипцию Ка,КАТФазы. Был обнаружен специфический ДНКсвязывающий белок, чувствительный к концентрации внутриклеточного свободного натрия. Таким образом, выявлено достаточно обширное влияние цитоплазматического натрия на разные звенья клеточной регуляции, в том числе на секрецию медиаторов, на свойства ионных каналов плазматической мембраны, на активность ферментных систем клетки, на у ровень свободного внутриклеточного кальция. В связи с вышеизложенным особое значение приобретает изучение известных и поиск новых механизмов, обеспечивающих проникновение натрия в клетки.