Молекулярно-генетические и физиолого-эмбриологические аспекты технологии получения трансгенных кроликов-продуцентов биологически активных веществ человека

• Автор: Тевкин, Сергей Иванович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Боровск
• Количество страниц: 146 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

1 .Обзор литературы.

1.1 Трансгенные кролики источники биологически активных рекомбинантных белков и модели болезней человека.

1.2. Основные способы введения генноинженерных конструкций в эмбрионы животных

1.3. Эффективность интеграции трансгена в геном млекопитающих

2. Материалы и методы исследований.

2.1. Получение кроличьих эмбрионов.

2.2. Генноинженерные конструкции использованные в работе

2.3. Получение культуральной среды, содержащей ретровирусную конструкцю.

2.4. Микроинъекция генноинженерных конструкций в зиготы.

2.5. Культивирование кроличьих эмбрионов i vi
2.6. Трансплантация эмбрионов самкамреципиентам.
2.7. Определение интеграции трансгена в геном эмбрионов и рожднного потомства
3. Результаты собственных исследований.
3.1. Изучение факторов, влияющих на эффективность получения потомства кроликов из зигот, микроинъецированных различными генноинженерными конструкциями
3.1.1 Суперовуляция у крольчих доноров эмбрионов разных пород и разного возраст
3.1.2. Приживляемость эмбрионов в организме крольчихреципиентов в зависимости от числа трансплантированных зигот, микроинъецированных генноинженерными конструкциями
3.1.3. Влияние породы и возраста крольчихреципиентов на сукрольиость и приживляемость эмбрионов.
3.2. Влияние микроинъекции в перивителлиновое пространство зигот культуральной среды, содержащей генноинженерную конструкцию, встроенную в ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов и интеграцию трансгена в геном первичных трансгенных кроликов
3.2.1. Приживляемость эмбрионов, развившихся из зигот, микроинъецированных генноинженерной конструкцией , встроенной в ретровирусный вектор, и интеграция трансгсна в геном рожденных кроликов.
3.2.2. Передача трансгена потомству первичными трансгенными животными, полученными с использованием генноинженерной конструкции, встроенной в ретровирусный вектор.
3.3. Изучение возможности получения трансгонных кроликов при введении ретровирусной конструкции в перивителлиновое пространство яйцеклеток, находящихся на стадии метафазы ГГ.
3.3.1. Приживляемость эмбрионов при трансплантации крольчихамдонорам извлечнных у них зигот метод донорреципиент.
3.3.2. Изучение возможности получения трансгенных животных при введении генноинженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, в ещ неоплодотворнные яйцеклетки, извлечнные из яйцеводов крольчих, осеменнных самцом
3.4. Влияние микроинъекции в пронуклеусы зигот различных плазмидных генноинженерных конструкций на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и частоту интеграции трансгена в геном рожднного потомства.
3.4.1. Влияние различных плазмидных генноинженерных конструкций на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и частоту интеграции трансгена на стадии эмбриона.
3.4.2. Приживляемость эмбрионов, микроинъецированных плазмидными генноинженерными конструкциями, в организме самокреципиентов и частота интеграции трансгена в геном рожденного потомства
3.5. Влияние микроинъекции в пронуклеусы кроличьих зигот плазмидной генноинженерной конструкции совместно с рестриктазой на жизнеспособность и ин
теграцию трансгена в геном эмбрионов.
3.5.1. Влияние совместной микроинъекции плазмидной генноинженерной конструкции с рестриктазой ХЬа1 на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и частоту интеграции трансгена, определенную на стадии бластоцисты
4. Обсуждение полученных результатов.
5. Выводы.
6. Практические предложения.
Список литературы


Исходя из вышеизложенного, для повышения эффективности технологии получения трансгенных животных необходимо изучение факторов, влияющих на интеграцию трансгена в геном хозяина и на жизнеспособность эмбрионов, инъецированных генноинженерными конструкциями, при получении трансгенных животных. Целью настоящей работы являлось изучение жизнеспособности эмбрионов и характера интеграции трансгена в геном кроликов при введении в зиготы различных генноинженерных конструкций. Получены трансгенные кролики с интегрированным геном гранулоцитколониестимулирующего фактора человека под промотором гена о7казеина крупного рогатого скота путем микроинъекции в перивителлиновое пространство зигот генноинженерной конструкции, встроенной в ретровирусный вектор v 1 . Изучен характер интеграции этой конструкции в геном рожденного потомства кроликов и передача трансгена по наследству. Установлено, что при введении ретровирусной конструкции в перивителлиновое пространство зигот интеграция трансгена носит мозаичный характер. Получены трансгенные кролики, несущие ген лактоферрина человека под контролем регуляторных элементов гена аказеина и лактоглобулина крупного рогатого скота и i, путем микроинъекции в пронуклеусы зигот плазмидных генноинженерных конструкций. Изучена частота интеграции в геном эмбрионов и рожденного потомства кроликов генноинженерных конструкций и I человека при введении их в пронуклеусы зигот. Результаты исследований, полученные в экспериментах по совместному введению в пронуклеусы зигот рестриктазы ХЬаТ с генноинженерной конструкцией, могут быть использованы для дальнейшей разработки способов, повышающих частоту интеграции трансгена в геном животных. Данные по развитию кроличьих зародышей после различных эмбриоинженерных манипуляций могут быть использованы при разработке технологии трансгеноза и при проведении исследований в области экспериментальной эмбриологии млекопитающих. Микроинъекция в перивителлиновое пространство зигот генноинженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, способствует увеличению частоты интеграции трансгена в геном эмбрионов и рожденного потомства, по сравнению с введением плазмидных конструкций в пронуклеусы зигот, но интеграция трансгена в геном первичных трансгенных кроликов при этом носит мозаичный характер. При микроинъекции в пронуклеусы кроличьих зигот плазмидных генноинженерных конструкций и аЗгСпНЬ частота интеграции трансгена в геном первичного рожднного потомства кроликов достоверно ниже, чем частота интеграции в эмбрионы, определнная на стадии бластоцисты. Крольчихи в возрасте до 2х лег лучше реагируют на гормональную обработку при вызывании суперовуляции и являются лучшими реципиентами для трансплантации зигот, микроипъекцированпых генноинженерными конструкциями. Получение трансгенных лабораторных животных позволяет изучать экспрессию и регулирование генов. В настоящее время, трансгенные мыши являются доступным объектом для изучения почти в каждом исследовательском учреждении. Но применение относительно более крупной модели трансгенных млекопитающих, траисгенных кроликов, открывает больше возможностей для исследователей. Первые трансгенные кролики были получены методом микроинъекции в пронуклеус . В дальнейшем эта методология была усовершенствована Vii . Кролик стандартное лабораторное животное для биомедицинских исследований трансгенные кролики используются как модели животных для изучения различных заболеваний человека. Известно, что в некоторых случаях, вызванные мутации, приводящие к заболеваниям человека, не дают начало соответствующим патологическим признакам у грызунов. Получению результатов при использовании трансгенных мышей также препятствует гибель животных в течение эксперимента. Кролик iii филогенетически ближе к приматам, чем мыши . Поэтому большинство исследователей выбрало трансгенного кролика как модель для изучения гипертрофической кардиомиопатии, нарушения метаболизма липопротеина и атеросклероза. Трансгенный кролик занимает промежуточное положение между лабораторной мышью и сельскохозяйственными животными.