Метаболическая регуляция в процессе роста и голодания культуры Escherichia coli M-17

• Автор: Момот, Елена Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 167 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Периодическое культивирование микроорганизмов. Фазы роста

1.1.1. Лагфаза

1.1.2. Экспоненциальный рост

1.1.3. Стационарная фаза роста

1.2. Авторегуляция роста и развития микробных популяций.

1.2.1. Автостимуляторы роста микроорганизмов

1.2.2. Автоингибиторы роста микроорганизмов.

1.2.3. Авторегуляторы выживаемости бактерий.

1.2.4. Специфические авторегуляторы развития популяций бактерий
1.2.5. Метаболическая авторегуляция роста и развития .i М
1.3. Некоторые аспекты метаболизма .i.
1.3.1. Катаболизм глюкозы.
1.3.2. Катаболизм ацетата, пирувата, лактата
1.3.3. Синтез и экскреция метаболитов.
1.3.4. Энергетический баланс метаболических процессов в клетках
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Культуры бактерий и условия их выращивания.
2.2. Расчет параметров кривой роста.
2.3. Выращивание культуры .i М в ферментере и получение
препаратов ее экзометаболитов АРК1 и АРК2
2.4. Определение влажности и зольности препаратов АРК.
2.5. Анализ состава низкомолекулярных экзометаболитов .i М
внеклеточной среды, препаратов АРК.
2.5.1. Спектроскопия протонного магнитного резонанса 1НЯМР
спектроскопия.
2.5.2. Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия
2.5.3. УФ спектроскопия.
2.5.4. Флуоресцентная спектроскопия.
2.5.5. Аминокислотный анализ
2.6. Анализ высокомолекулярной фракции внеклеточной среды,
электрофорез белков.
2.7. Определение биологической активности экзометаболитов
.i М.
2.7.1. Выращивание в колбах на качалке
2.7.2. Выращивание в стационарных условиях
2.7.3. Метод растетне растет.
2.7.4. Выращивание смешанных культур .i М и .iii Е.
2.8. Определение выживаемости .i М и .iii при хранении
в чистых и смешанных культурах
2.9. Статистическая обработка данных
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Состав экзометаболитов .i М.
3.1.1. Исследование низкомолекулярной фракции внеклеточной среды
.i М.
3.1.2. Исследование высокомолекулярной фракции внеклеточной среды
.i М.
3.2. Влияние экзометаболитов на рост .i М
3.2.1. Влияние экзометаболитов на рост культуры в стационарных
условиях при низких плотностях засева. Инициация роста культуры.
3.2.2. Влияние экзометаболитов на рост культуры в колбах на качалке при
нормальных плотностях засева. Динамика роста культуры.
3.2.3. Биологические свойства экзометаболитов голодания действие
препарата АРК2 и соответствующей композиции Комп2 на динамику роста .i М.
3.3. Динамика экзометаболитов в процессе роста культуры .i М.
3.3.1. Динамика экзометаболитов при выращивании .i М в колбах
на качалке.
3.3.2. Динамика экзометаболитов при выращивании .i М в
ферментере.
3.4. Потребление экзометаболитов клетками .i М
3.4.1. Рост .i М на экзометаболитах. Использование
экзометаболитов в качестве единственных источников питания.
3.4.2. Динамика концентраций экзометаболитов при их добавлении в
среду культивирования
3.5. Влияние экзометаболитов на антагонистическую активность .i
М. Действие экзометаболитов на рост смешанных культур.
3.6. Влияние экзометаболитов на голодающую культуру .i М
3.6.1. Выживаемость чистых и смешанных культур .i М и
iii Е.
3.6.2. Влияние экзометаболитов на выживаемость .i М и
.iii Е при голодании в чистых и смешанных культурах
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В дальнейшем Хенричи показал наличие положительной корреляционной связи между скоростью роста культуры и средним размером клеток. Изменение среднего размера клеток сопровождалось изменением стандартного отклонения и характера распределения бактерий по размеру. При сравнительно высокой плотности засева 2,3 млн. Уменьшение плотности засева вплоть до 5 тысяч клмл приводило к возрастанию максимальной скорости роста на логарифмической фазе и увеличению максимального среднего размера бактерий. Распределение клеток по размеру при этом принимало бимодальный характер с преобладанием моды клеток большего размера. Бимодальность наблюдалась не на всех стадиях роста. В наибольшей степени она была выражена на ранней логарифмической фазе, еще до достижения клетками их максимального размера. Наличие бимодальности Хенричи связывал с тем, что в силу гетерогенности популяции увеличение размеров индивидуальных бактерий происходило с различной скоростью. На наш взгляд причина здесь иная и заключается в том, что одни клетки способны приступать к делению при меньшем объеме, чем другие. Кроме того, из опытов Хенричи следует, что эта способность связана с плотностью популяции бактерий, то есть является одним из проявлений так называемого эффекта кворума см. Другое проявление эффекта касается кажущейся противоречивости данных Хенричи и некоторых других исследователей см. Хенричи, а сразу после окончания поздней лагфазы, то есть перед началом интенсивного деления бактерий В экспериментах этих авторов как правило изучался рост значительно более плотных культур, чем в опытах Хенричи. На основании сопоставления этих данных, можно сделать вывод о том, что в более плотных популяциях критическая масса клеток, необходимая для инициации их деления, существенно меньше, чем в менее плотных. Этот же вывод вытекает и из результатов самого Хенричи. Вполне возможно поэтому, что инициация клеточного деления стимулируется определенными экзометаболитами бактерий, концентрация которых выше в более плотных популяциях. Приведенные факты свидетельствуют о том, что экспоненциальный рост периодической культуры не является вполне сбалансированным. Были выявлены осцилляции скорости роста у . i i, i ii и других микроорганизмов, связанные с изменениями активности ряда ферментных систем, принимающих участие в метаболизме источника энергии , , . Стационарная фаза роста. Процесс перехода культуры на стационарную фазу сопровождается значительными изменениями структуры бактериальной популяции и характеристик отдельных клеток . Было показано, что клетки стационарной фазы обладают низкой физиологической активностью , , , относительно небольшим размером , . При этом возрастает устойчивость клеток к воздействию неблагоприятных факторов , , и гетерогенность популяции по репродуктивной способности микроорганизмов , . Долгое время считалось, что основными причинами остановки роста бактериальных культур и перехода их в стационарное состояние являются неспецифические факторы истощение питательных веществ, изменение среды, кислородное голодание, неспецифическое действие продуктов метаболизма. Однако уже с начала прошлого века начали накапливаться факты, свидетельствующие о том, что остановку роста культур невозможно объяснить действием только неспецифических факторов. Действительно, в опытах по выращиванию микроорганизмов в условиях компенсации убывающих компонентов среды, насыщения кислородом, поддержания оптимальных значений не удавалось получить плотную микробную массу, т. С другой стороны, среда, отфильтрованная от культуры со стационарной стадии, могла быть вторично использована для выращивания вновь засеянных клеток , , 6. Впервые гипотеза о наличии популяционных механизмов регулирования численности микроорганизмов была выдвинута Хенричи . Остановка роста по его мнению происходит изза ограниченности физического пространства эффект толпы. При этом увеличение концентрации микроорганизмов приводит к повышению частоты межклеточных контактов, которые могут являться специфическим сигналом для завершения роста культуры.