Совершенствование методов введения гена в пронуклеусы зиготы и получение трансгенных кроликов с геном гранулоцитарного колониестимулирующего фактора

• Автор: Шепель, Никита Иванович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: п. Ленинские горы, Московской обл.
• Количество страниц: 132 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. Обзор литературы.

1.1. Получение и использование трансгенных животных.

1.1.1. . Методы переноса генов

1.1.1.1. Перенос генов посредством микроинъекции ДНК

1.1.1.2. Транспорт ДНК с использованием ретровирусных векторов.

1.1.1.3. Пересадка ядер транфецированных генами.

1.1.1.4. Использование сперматозоидов в качестве векторов экзогенного

1.1.2. Экспрессия генов.

1.1.3. Области применения транспорта генов.

1.1.3.1. Рост и развитие животных.

1.1.3.2. Получение молока с желаемыми свойствами.
1.1.3.3. Повышение качества и выхода шерсти у овец.
1.1.3.4. Повышение устойчивости сельскохозяйственных животных к
инфекционным заболеваниям.
1.1.3.5. Биологическое моделирование патологических состояний
человека.
1.1.3.6. Создание трансгенных животных доноров органов для
трансплантации человеку.
1.1.3.7. Трансгенные животные продуценты биологически активных
веществ медицинского назначения и для перерабатывающей промышленности.
1.1.3.8. Выбор вида для получения трансгенных животных
1.1.3.9. Кролик, как продуцент гранулоцитарного
колониестимулирующего фактора ГКСФ
1.1.3 Биология, функция методы получения и применения
гранулоцитарного колониестимулирующего фактора ГКСФ
2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования
2.2. Генные конструкции
2.3. Подбор доноров и реципиентов
2.4. Схема гормональной подготовки доноров
2.5. Синхронизация овуляции у реципиентов.
2.6. Методика извлечения зигот у кроликов.
2.7. Оценка полученных эмбрионов и микроинъекция гена.
2.8. Пересадка микроинъецированных эмбрионов
2.9. Методика получения вазектомированных самцов кроликов.
2 Получение и выращивание крольчат.
2 Молекулярногенетический анализ
. Выделение геномной ДНК и анализ интеграции.
. Полимеразная цепная реакция
3. Результаты исследований.
3.1. Изучение возможности применения нового способа транспорта
гена после инъекции в цитоплазму зиготы.
3.1.1. Сравнительная оценка разных способов стимуляции
суперовуляции.
3.1.2. Влияние микроинъекции на развитие эмбрионов i vi.
3.1.3. Эффективность трансплантации микроинъецированных
эмбрионов.
3.1.4. Анализ интеграции трансгена
3.2. Получение трансгенных кроликов с геном гранулоцитарного
колонестимулирующего фактора ГКСФ.
3.2.1. Изучение ряда факторов на эффективность стимуляции
суперовуляции и получение эмбрионов и потомков.
3.2.2. Изучение влияния разных способов извлечения зигот кроликов н
выход эмбрионов.
3.2.3. Изучение качества извлеченных зигот и яйцеклеток после
стимуляции суперовуляции у кроликов.
3.2.4. Изучение качества микроинъецированных эмбрионов кроликов
при культивировании i vi.
3.2.5. Изучение эмбриональных потерь в плодный период у кроликов
после введения микроинъецированных зигот.
3.2.6. Изучение влияния возраста пронуклеуса на эффективность
интеграции гена.
3.2.7. Изучение эффективности получения трансгенных кроликов с
введением в зиготу.
3.2.8. Изучение интеграции генной конструкции в плодах
кроликов после пересадки микроинъецированных зигот.
4. Обсуждение результатов исследований.
5. Выводы.
6. Практические предложения.
7. . Литература.
аЛак
АЬУ
АЛЕ
Ьо
СНО
БАР
Е

ьвн
КЛМ
1.
Руите
Принятые сокращения
агантитрипсин алакто глобулин аденовирус Н5 вирус лейкоза кур ампициллин
область, содержащая АТбогатые элементы
Рлактоглобулин
казеиновый
яичник китайского хомячка
мышиный цитомегаловирус
фактор, усиливающий отторжение
ди гидре фол атредуктаза
эмбриональные стволовые клетки
зеленый флуоресцирующий белок
глобулиновый
человеческий
гормон роста человека
ген интерлейкина человека
инсулиноподобный фактор рост
иммуноглобулин
мембранный кофакторный белок
сигнал ядерного транспорта
кроличий
участок длинного терминирующего повтора вируса саркомы Рауса додеци л сульфат натрия
БЬ Ые фактор устойчивости актиномицетов к блеомицину
БУ вирус саркомы Рауса
РА тканевой плазминогенный активатор
итя нетранслируемая область
кислый белок сыворотки молока
ААТ агантитрипсин
асРНК антисмысловая рибонуклеиновая кислота
БГР бычий гормон роста
БЛВ вирус лейкоза крупного рогатого скота
ГКСФ гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
ГМКСФ гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор
ГнРГ гонадотропный рилизинг гормон
ГР гормон роста
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
дНТФ дезоксирибонуклеотидтрифосфат
ИЕ интернациональные единицы
к ДНК комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
КОЕ колонисобразующая единица
КРС крупный рогатый скот
КСФ колонесимулирующий фактор
ЛГ лютеотропный гормон
МЕ международные единицы
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
МСН главный комплекс гистосовместимости
ПГФ простогландин
ПЦР полимеразная цепная реакция
пял полиморфноядерный лейкоцит
РНК рибонуклеиновая кислота
хлорамфениколацетилтрансфераза
СЖК сыворотка жеребых кобыл
СПИД синдром приобретнного иммунодефицита
СТГ соматотропный гормон
ФСГ гипофизарный фолликулостимулирующий гормон
ХГ хорионический гонадотропин
ЧГР гормона роста человека
ЧХГ человеческий хорионический гормон
ВВЕДЕНИЕ


Для эмбрионов овцы и козы не требуется центрифугирования. Для визуализации пронуклеусов у этих видов животных достаточно применять оптику Номарского с интерференционным контрастом. Для успешного выполнения экспериментов по транспорту генов кроме способа переноса генов необходимо владеть методами вымывания эмбрионов и их пересадки, а также четко знать временные границы выполнения операций для каждого вида животных. После короткого культивирования i vi эмбрионы большинства видов животных трансплантируют в яйцевод синхронизированных реципиентов хирургическим методом. У крупного рогатого скота хорошо отработана техника нехирургической пересадки эмбрионов в один из рогов матки. Синхронизация полового цикла у донора эмбрионов и у реципиента является необходимым условием для успешного выполнения процесса по пересадке микроинъецированных эмбрионов, так как яичники, яйцеводы и матка должны находится в соответствующей стадии полового цикла, чтобы физиологически обеспечить дальнейшее развитие пересаженных эмбрионов. Синхронизация эструса у мышей и кроликов достигается спариванием с вазэктомированным самцом, стимуляцией овуляции человеческим хорионическим гормоном ЧХГ или гонадотропным рилизинг гормоном Гн РГ. У крупных домашних животных, крупного рогатого скота, свиней, овец и коз синхронизацию охоты и овуляции вызывают обработкой аналогов простагландина 2 или прогестагенной обработкой и дополнительным введением ЧХГ или Гн РГ. С целью увеличения числа зигот у животных доноров вызывают суперовуляцию путем однократной инъекции сыворотки жеребых кобыл СЖК или многократной инъекцией гипофизарного фолликулстимулирующкго гормона ФСГ отдельно или в сочетании с ЛГ. Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи пересаживают инъецированных зигот. Причем у свиней все эмбрионы транспортируют в один яйцевод, а у мышей и кроликов раздельно по яйцеводам. Животных, родившихся из инъецированных эмбрионов, исследуют на наличие интеграции чужеродной ДНК. Интеграцию ДНК проверяют методами ПЦР, дот и блот гибридизацией по Саузерну. Клонирование генных конструкций и приготовление раствора ДНК для микроинъекции. Подготовка доноров и извлечение эмбрионов. Обнаружение пронуклеусов под микроскопом в эмбрионах животных и микроинъекция ДНК. Пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или в матку синхронизированных реципиентов. Определение интеграции гена у родившихся потомков. Размножение трансгенных животных с использованием традиционных методов разведения. Изучение экспрессии гена у исходных трансгенных животных и их . Для получения трансгенных животных имеет значение получение таких животных, у которых, по крайней мере, часть половых клеток имеют трансген. Установлено, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях развития эмбриона могут появляться мозаики. Мозаиками считаются животные, состоящие из двух или нескольких клеточных линий, происходящими из одной зиготы, но имеющих разные генотипы. Трансгенные мозаики кроме клеток, содержащих трансген, имеют нетрансгенные клеточные линии. Если клетки гонад не содержат трансген, то потомство не может наследовать инъецированный ген от трансгенного родителя. Таким образом, трансгенные мозаики появляются, как правило, только в исходной генерации , а в последующих поколениях трансгенные потомки содержат генную конструкцию во всех соматических и эмбриональных клетках. По литературным данным первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции, являются мозаиками. Т.М. При интеграции возможно присоединение фрагментов ДНК последовательно друг к другу в виде цепочки, состоящей из нескольких сотен копий рекомбинантной ДНК. Это наблюдалось у овец, мышей, свиней, кроликов. Мышей, свиней. V . Перестройки генных конструкций явление нередкое при анализе трансгенов, они описаны у мышей, овец. V . Эффективность интеграции генов у животных, особенно у крупных сельскохозяйственных животных, очень низкая Таблица 1. Одним из приемов повышения эффективности микроинъекции генов является идентификация интеграции гена в эмбрион до пересадки реципиенту. Т. .