Развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота и мышей in vitro, в зависимости от условий их реконструирования и культивирования

• Автор: Кириенко, Константин Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Боровск
• Количество страниц: 138 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Методические приемы клонирования

1.2. Активация.

1.3. Влияние типа клетокдоноров и их генотипа на результативность технологии клонирования.

1.4. Влияние фазы клеточного цикла ядра донора на эффективность клонирования

1.5. Влияние условий культивирования i vi на развитие эмбрионов млекопитающих.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

II. Объекты и методы исследований

2.1. Получение клеток источников цитопластов.

2.2. Получение клеток источников кариопластов
2.3. Реконструирование клеток
2.4. Слияние кариопластов с цитопластами.
2.5. Активация цитопластов.
2.6. Культивирование реконструированных и партеногенетически активированных клеток.
2.7. Трансплантация реконструированных эмбрионов самкам реципиентам.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Изучение факторов, влияющих на изменение местоположения метафазной пластинки и полярного тельца в ооцитах крупного рогатого скота и мышей
3.2. Определение оптимальных режимов электрослияния кариопластов и цитопластов различного происхождения
3.3. Анализ факторов влияющих на активацию реконструированных и партеногенетических эмбрионов
3.4. Влияние различных сред для культивирования i vi на развитие партеногенетически активированных мышиных
эмбрионов .
3.5. Развитие i vi клонированных мышиных эмбрионов, реконструированных с использованием в качестве кариопластов ядер клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла
3.6. Изучение влияния различных культуральных систем на развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота i
3.7. Развитие партеногенетических и реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота в средах и под газовой фазой 5 С 5 2
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Выявлено, что причиной интенсивной миграции I полярного тельца в перивителлиновом пространстве относительно метафазной пластинки, наблюдаемой в мышиных ооцитах при энуклеации, являются механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса и различными перемещениями ооцита. Установлено, что цитопласты, полученные путм энуклеации ооцитов крупного рогатого скота, дозревавших i vi в течение часов, способны репрограммировать ядра соматических клеток взрослых животных и обеспечивать развитие реконструированных эмбрионов i vi до стадии бластоцисты. Установлено, что воздействие фактором, ингибирующим фосфорилирование белков 6диметиламинопурином 6, на реконструированные клетки крупного рогатого скота и мышей сразу после активации их ионофоромСа препятствует переходу этих клеток в метафазу III, и способствует их дальнейшему развитию до стадии бластоцисты. Практическая значимость. Результаты исследований, полученные при изучении динамики местоположения метафазной пластинки относительно I полярного тельца ПТ, могут быть использованы для повышения результативности процесса энуклеации яйцеклеток млекопитающих. Результаты исследований, направленных на установление оптимальных режимов электрослияния кариопласта с цитопластом и на определение условий активации реконструированных клеток, могут быть использованы для повышения эффективности реконструирования эмбрионов млекопитающих разных видов. Результаты исследований, полученные при изучении влияния фазы клегочного цикла ядра соматической клетки, используемого в качестве кариопласта, на последующее развитие реконструированных эмбрионов, могут быть использованы в работах по получению клонированных млекопитающих. Система культивирования в среде на фидерном слое под газовой фазой 5 С в воздухе, а также в среде и с добавлением заменимых и незаменимых аминокислот под газовой фазой 5 С, 5 , 2, может быть использована для культивирования естественно оплодотворенных, партеногенетически активированных и реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота. Положения выносимые на защиту. В мышином ооците, находящемся на стадии метафазы II, в течение первых 34 часов после первого мейотического деления не происходит существенной миграции ни метафазной пластинки относительно I полярного тельца, ни I полярного тельца относительно метафазной пластинки. Причиной интенсивной миграции I полярного тельца в перивителлиновом пространстве относительно метафазной пластинки, наблюдаемой в мышиных ооцитах при энуклеации, являются механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса. Активация клеток крупного рогатого скота и мышей, реконструированных с использованием в качестве кариоиластов ядер свежеполученных клеток кумулюса, только электрическим током в процессе электрослияния или с последующей дополнительной активацией 7 этанолом, не позволяет получить приемлемого выхода клонированных эмбрионов на стадии бластоцисты. Воздействие фактором, ингибирующим фосфорилирование белков, на реконструированные клетки крупного рогатого скота и мышей сразу после активации их ионофоромСа, препятствует переходу этих клеток в стадию метафазы III. Эмбрионы крупного рогатого скота, реконструированные путм трансплантации ядер клеток кумулюса взрослых животных в энуклеированные ооциты, дозревавшие i vi, развиваются до стадии бластоцисты в простой синтетической среде яйцевода мышей с оптимизированным содержанием калия , под газовой фазой 5С, 5,2. Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных отчтных сессиях ВНИИФБиП в период с по г. Международной научно практической интернетконференции Управление функциональными системами организма г. IV Международной конференции Актуальные проблемы биологии в животноводстве г. Боровск, 57 сентября г. VI Международной научной конференции Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных п. Дубровицы, декабря г. IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова г. Пущино, 67 декабря г. IV съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова г. Пущино, 67 декабря г.