Разработка технологии производства ферментного препарата из молока овец, трансгенных по гену химозина крупного рогатого скота

• Автор: Ермолаев, Владимир Игоревич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: п. Горки Ленинские, Московской обл.
• Количество страниц: 168 с. : ил.

1. Обзор литературы

1.1. Биохимические свойства химозина

1.1.1. Химический состав химозина.

1.1.2. Разделение и очистка реннина.

1.1.3. Влияние внешних условий на активность химозина.

1.1.4. Молокосвертывающие свойства нативного и рекомбинантного

реннина. .

1.2. Генетическая организация химозина.

1.3. Сычужный фермент

1.3.1. Активность сычужного фермента.

1.3.2. Состав сычужного фермента.

1.3.3. Методы очищения реннина.
1.3.4. Сырье и химические реагенты
1.3.5. Производство жидкого сычужного фермента.
1.3.6. Производство сычужного порошка.
1.4. Заменители химозина
1.5. Синтез рекомбинантного химозина
1.6. Грансгенные животные, продуцирующие с молоком
биологически активные вещества.
1.7. Экологическая экспертиза рекомбинантных пищевых белков.
1.8. Производство и переработка овечьего молока
1.8.1. Состав овечьего молока.
1.8.2. Гигиенические требования к овечьему молоку
1.8.3. Отары дойных овец.
1.8.4. Доильные пункты.
1.8.5. Доение овец.
1.8.6. Анализ молока
2. Материалы и методы исследований.
2.1. Условия проведения опытов.
2.2. Определение молокосвертывающей активности сыворотки молока трансгенных овец, пастообразной и порошковой
формы молокосвертывающего препарата.
2.3. Определение молокосвертывагощей активности химозина из
молока трансгенных овец, выделенного с использованием ионнообменной хроматографии.
2.4. Экспрессметод определения присутствия прохимозина в молоке
трансгенных овец.
2.5. Определение зависимости протеолитческой активности
трансгенного химозина от по расщеплению белкового субстрата гемоглобина.
2.6. Определение активности трансгенного химозина по расщеплению
казеината натрия.
2.7. Определение массовой доли поваренной соли.
2.8. Определите количества микроорганизмов
2.9. Выделение и концентрирование фермента химозина из молока
трансгенных овец.
3. Результаты исследований.
3.1. Предварительное изучение возможности активации
прохимозина в молоке трансгенных овец.
3.2. Влияние уровня и добавления пепсина к сыворотке молока
трансгенных овец на молокосвертывающую активность.
3.3. Выявление оптимальных значений для превращения
прохимозина в химозин в молоке трансгенных овец.
3.4. Изучение влияния количества колониеобразующих бактерий
сыворотки молока трансгенных овец на ее молокосвертывающую активность при различных значениях и времени хранения.
3.5. Изучение влияния концентрации ЫаС1 в сыворотке молока
трансгенных овец при выделении химозина на выход стандартного продукта.
3.6. Влияние температуры хранения на поддержание
молокосвертывающей активности фермента и рост количества колониеобразуюших бактерий в пастообразной форме ферментного продукта.
3.7. Влияние времени хранения порошкового препарата химозина на
его молокосвертывающую активность.
3.8. Разработка экспрессмстода определения присутствия
прохимозина в молоке трансгенных овец в условиях сельскохозяйственного производства.
3.9. Изучение динамики экспрессии гена химозина у трансгенных
овец в течение лактации.
3 Доказательство идентичности химозина, выделенного из молока
трансгенных овец химозину теленка.
. Выделение химозина из молока трансгенных овец с помощью
хроматографии.
. Исследование химозина из молока трансгенных овец,
очищенного с помощью афинной хроматографии.
. Определение зависимости протеолитческой активности
трансгенного химозина от по расщеплению белкового субстрата гемоглобина.
. Определение активности трансгенного химозина по
расщеплению казеината натрия.
4. Экономическая эффект ивность производства
молокосвертывающего ферментного препарата из молока трансгенных овец.
5. Обсуждение результатов исследований.
6. Выводы.
7. Практические предложения.
Приложения.
Использованная литература.
Введение


После промывки колонки, граница химозина была элюирована с помощью 1,7 М или vv водного этилен гликоля. Соль элюата была подвергнута анализу и выяснилось, что она содержит больше чистого химозина. Часть, которая была пропущена через унадсорбацию, содержала больше чем чистого пепсина. Таким образом, этил методом было произведено полное разделение химозина и пепсина без необходимости уничтожения одного из двух ферментов i . После электрофореза, отделенные компоненты визуализировались фиксацией с синечерным анилином. Два известных белка были найдены в телячьем и говяжьем реннине, в то время как только 1 главный белок наблюдался в пепсине и ферментах микробиального происхождения. Диффузия геля простая и чувствительная методика для проверки ингибиторов протеиназ и для определения отношения протеин аз в смесях. В казеинсоде ржащих агарозных гелях, пепсин и химозин формирует радиальные зоны диффузии диаметры этих зон показывают линейные корреляции с логарифмом концентрации фермента в постоянном времени. Чувствительность для обоих ферментов ниже 1 микрограмма. Дополнение ингибитора пепстатина к этим ферментам вызывает сокращение диаметров зон диффузии, с большими различиями для обоих ферментов. С этой процедурой, отношение пепсинхимозин в реннине определялось с точностью 5 . Этот метод прост для оценки протеиназ и их ингибиторов i . Хроматография коммерческого реннина анализировалась на биоспецифических сорбентах, полученных посредством связи активизированной 4В с iii сложным эфиром метила и амида, iii сложный эфир метила, iii и 2,4iixii. Смесь двух таких подобных ферментов как химозин и говяжий пепсин была изолирована от реннина хроматографией на этих сорбентах. Индивидуальные ферменты изолировагш хроматографией на иммобилизированной рибонуклеазе при 3,0, или посредством электрофокусирования при . Цветной ингибитор кислотных протеаз, i2,4iiii подобран к инактивированному химозину при 5,6 в присутствии Си2, один остаток ингибитора, присоединяемого к молекуле фермента. В отличие от свиного пепсина, химозин не ингибировался с при 4,7 и отношение в фермент 2 было как 1 v V, vv . I, i . Моноспецифичсские антитела кролика были произведены против говяжьего химозина и пепсина и использовались для количественных измерений этих ферментов ракетным иммуноэлектрофорезом. Говяжий пепсин В был идентифицирован и измерялся количественно на ii, используя полиспецифические препараты антител. Хроматографически очищенный химозин В и пепсины А и В использовались как стандарты. Содержание химозина и пепсина было также определено 2 формами хроматографии, и проверкой, использующей отношение молокосвертывающей акгивности при 6,0 и 6,5. Преимущества иммунохимических методов прямая и одновременная идентификация и количественный анализ ферментов , x . Влияние внешних условий на активность химозина. Прохимозин достаточно стабилен в растворе при от 5,5 до 9,0. Лвтокаталитическая активация прохимозина происходит при ниже 5,0. Этот процесс существенно зависит от ионной силы ii . Суспензия высокоочшцешюго химозина так же, как и раствор сычужного фермента, стабильна при температуре ниже 5 и 5,,3 i . При 3,5 и 7,0 фермент быстро теряет свою активность. Химозин наиболее растворим в присутствии I, причем его растворимость зависит от концентрации соли в 2М I его растворимость составляет мгмл. I менее 1 мгмл. Изоэлектрическая точка химозина соответствует значению около 4,6. Молекулярная масса прохимозина ,8 кД, химозина ,7 кД. Изучались свойства протеолитических ферментов, которые производят из сычугов телят, и из . Обе молокосвертывающие протеиназы имели оптимальную активность при 5,2 и градусах С. Микробиологический реннин имеет второй пик максимальной активности при 3,5 и градусах С. Температура более чем градусов С вызывают быстрое уменьшение деятельности. Поведение активности фермента изменяется с изменением субстрата и концентрацией фермента. Однако, для телячьего реннина показатель увеличения скорости свертывания субстрата с увеличением количества фермента явно отличается от микробиологического комплекса реннина I.