ПЦР-диагностика криптоспоридиоза кур

• Автор: Уездина, Анастасия Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.19
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Оглавление.
1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Историческая справка

2.2. Таксономия возбудителя

2.2.1. Биология возбудителя

2.3. Эпизоотология криптоспоридиоза

2.4. Симптомокомплекс

2.5. Патогенез

2.6. Иммунитет

2.7. Диагностика

2.8. Молекулярные методы в диагностике протозойных инфекций
2.8.1. Методы и условия повышения эффективности реакции амплификации ДНК
2.9. Лечение, профилактика, меры борьбы с криптоспоридиозом
3.Собственные исследования
3.1. Материалы и методы
3.1.1. Штаммы и ДНК микроорганизмов использованные при разработке экспериментальной тестсистемы ПЦР для выявления и идентификации ii i
3.1.2. Химические реактивы
3.1.3. Общая характеристика специализированных хозяйств
3.1.4. Заражение лабораторных животных ооцистами ii ii, ii v
4. Диагностика криптоспоридиоза в ПЦР лаборатории
4.1. Условия проведения полимеразной цепной реакции
4.2. Сбор клинического материала для выделения ДНК возбудителя
4.2.1. Первичная подготовка клинического материала для выделения ДНК сорбентаым методом
4.2.2. Подготовка клинического материала для постановки ПЦР реакции лизирующим методом с протеиназой К
4.3. Рестрикция ДНК и электрофорез в агарозном геле
4.4. Ферментативная обработка препаратов ДНК
4.5. Техника приготовления 5х ТБЭ
4.6. Приготовление 1,5 агарозного геля
4.7. Очистка и концентрация ДНК
4.7.1. Переосаждение ДНК спиртом
4.8. Регистрация результатов полимеразной цепной реакции
5. Результаты исследований
5.1 .Тестсистема ПЦР для идентификации ii i
5.2. Выбор праймеров и определение чувствительности метода анализа
5.3. Обоснование специфичности амплификации выбранной для экспериментальной диагностики нуклеотидных последовательностей с использованием полевых штаммов ii i и v, эмерий и эталонных штаммов x ii
5.3.1. Экспериментальное определение оптимальных условий проведения ПЦР реакции
6. Динамика выделения ооцист криптосноридий лабораторными животными в период наблюдения
7. Патологоанатомические изменения
8. Определение степени зараженности криптспоридиозом птицы разной возрастной категории
9. Обсуждение результатов
. Заключение
. Выводы
. Список литературы
. Приложение литературы
1. Введение.
Актуальность


Мыши, крысы и морские свинки также заражаются ооцистами криптоспородий, но без проявления клиники болезни, будучи при этом резервуаром для инфицирования домашних животных. У птиц криптоспоридиоз чаще имеет респираторную форму, реже кишечную. Частота поражения респираторного тракта у млекопитающих окончательно не изучена. Ооцисты криптоспоридий обладают чрезвычайной устойчивостью к разным лечебным антимикробным и антипаразитарным веществам, а также дезинфицирующим средствам. ., v I. В своих исследованиях мы исходили из интереса к изучению опасного антропозооноза криптоспоридиоза птиц. Актуальность проблемы криптоспоридиоза птиц обусловлена отсутствием надежных экспрессметодов диагностики, что и определило цель и задачи наших исследований. Цель и задачи работы. Изучить распространенность криптоспоридиоза кур в Саратовской и Московской областях разработать диагностическую тестсистему на основе ПЦР для выявления возбудителя криптоспоридиоза кур. Апробировать разработанную ПЦР тестсистему в экспериментальных условиях на таксономическую специфичность, включая использование клинического и патологического материала от естественно зараженной птицы и лабораторных животных. ii i. Научная новизна. ПЦР. Практическая значимость. Разработаны методические указания по применению экспериментальной тестсистемы ПЦР для выявления ДНК ii i, которые рассмотрены и одобрены Ученым советом ВИЭВ. Представленные результаты наших исследований могут быть использованы в практической ветеринарии для прижизненной и посмертной диагностики криптоспоридиоза птиц. ПЦР для диагностики криптоспоридиоза кур. РФ. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на научнопроизводственных конференциях, Ученом совете ВИЭВ , межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ . Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 научных работы, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 6 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 7 таблицами, 7 рисунками. Список литературы включает 8 источников, из них зарубежных. Обзор литературы. Историческая справка. Поражение кишечника криптоспоридиями было впервые описано Е. Туггег в году. Возбудитель был обнаружен в слизистой оболочке желудка у лабораторной мыши без признаков патологии желудочнокишечного тракта. В течение лет криптосноридий считали безвредным комменсалом. Первый случай заболевания, взванного кринтоспоридиями, был зарегистрирован в г. Позднее последовали сообщения об аналогичных заболеваниях среди млекопитающих. В году был описан первый случай заболевания криптоспоридиозом человека. У людей это заболевание встречается чаще всего в теплые, дождливые и влажные месяцы года. В процессе многочисленных исследований последних лет стало ясно, что представители рода криптоспоридий наиболее часто вызывают заболевание у лиц с симптомами иммунодефицита. Таксономия возбудителя. Род ii принадлежит к семейству iii, отряду iii, классу , подтипу ix. Криптоспоридии являются облигатными паразитами, инфицирующими микроворсинки слизистой оболочки желудочнокишечного тракта и дыхательных путей животных и человека. Первоначально считалось, что различные криптоспоридии строго специфичны по отношению к определенному виду позвоночных, что послужило основанием для построения их классификации. Однако в дальнейшем опыты по перекрестному инфицированию показали, что криптоспоридии менее специфичны, чем предполагалось ранее. И в году ранее существовавшие виды вид были объединены в 4 вида. В настоящее время род iii официально включает 6 видов С , инфицирующая рыб, С. С. ii и С. С. v и С. Следует подчеркнуть, что практически все случаи заболевания криптоспоридиозом у людей были вызваны С.