Диагностика протозойных заболеваний животных с помощью полимеразной цепной реакции

• Автор: Кузнецова, Эльвира Алексеевна
• Шифр специальности: 03.00.19
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 179 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Полимеразная цепная реакция как один из методов генодиагностики

1.1.1. Принцип метода.

1.1.2. Преимущества полимеразной цепной реакции как метода диагностики инфекционных, инвазионных заболеваний животных и человека
1.1.3. Задачи в современной инфекционной и инвазионной патологии, которые можно решать с помощью полимеразной цепной реакции.
1.1.4. Практические требования к подбору условий проведения полимеразной цепной реакции.

1.1.4.1. Основные требования к компонентам полимеразной цепной реакции.

1.1.4.1.1. Фермент Таяполимераза.

1.1.4.1.2. ДНК

1.1.4.1.3. Олигонуклеотидные праймеры.
1.1.4.1.4. Концентрация ионов М
1.1.4.1.5. Дезоксину кл еоти дтрифосфаты дНТ Ф
1.1.4.2. Выбор режима проведения полимеразной цепной реакции
1.1.5. Регистрация результатов полимеразной цепной реакции
1.1.6. Предупреждение ложноположительных и ложноотрицательных результатов полимеразной цепной реакции.
1.2. Современные модификации полимеразной цепной реакции.
1.3. Альтернативные ПЦРметоды амплификации нуклеиновых
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы
2.1.1. Материалы.
2.1.1.1. Штаммы и ДНК микроорганизмов, эукариотичексие ДНК, использованные при разработке ПЦР тестсистем для идентификации x ii, i.
2.1.1.2. Лабораторные животные
2.1.1.3. Клинический и патологический материал
2.1.1.4. Оборудование и химические реактивы.
2.1.2. Методы
2.1.2.1. Полимеразная цепная реакция
2.1.2.1.1. Выделение хромосомной ДНК из культур клеток x ii, i, i . сыворотки крови, образцов тканей глаз, головного и спинного мозга, сердца, легких, печени, селезенки, почек, мышечной ткани.
2.1.2.1.2. Определение концентрации ДНК.
2.1.2.1.3. Выбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции ПЦР
2.1.2.1.4. Условия проведения полимеразной цепной реакции.
2.1.2.1.5. Регистрация результатов полимеразной цепной реакции.
2.1.2.1.6. Предупреждение ложноположительных и ложноотрицательных результатов полимеразной цепной реакции
2.1.2.2. Определение чувствительности разработанных ПЦР тестсистем для диагностики протозойных заболеваний животных
2.1.2.3. Разработка контрольных ПЦРпозитивных образцов ДНК нового типа
2.1.2.4. Моделирование острой токсоплазмозной инвазии на лабораторных животных.
2.1.2.5. Проведение иммунологических методов диагностики.
2.1.2.5.1. Иммуноферментный анализ ИФА.
2.1.2.5.2. Реакция непрямой иммунофлюоресценции РНИФ.
2.2. Результаты исследований и их обсуждение.
2.2.1. Генетическое типирование близкородственных паразитических простейших x ii, i и i . методом полимеразной цепной реакции с помощью универсальных праймеров .
2.2.2. Разработка ПЦР тестсистемы для диагностики токсоплазмоза
животных
2.2.2.1. Подбор оптимальной методики выделения ДНК из культур
клеток x ii, i, i .
2.2. Выбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров
для проведения полимеразной цепной реакции
2.2 Подбор оптимальных условий проведения ПЦРанализа
2.2.2.4. Проверка таксономической специфичности ПЦР тестсистемы для идентификации x ii.
2.2.2.5. Определение чувствительности ПЦР тестсистемы для
идентификации x ii
. Разработка программы постановки полимеразной цепной реакции для данной тестсистемы в быстром режиме амплификации
2.2.3. Разработка ПЦР тестсистемы для диагностики неоспороза животных.
2.2.3.1. Выбор и синтез специфических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции.
2.2.3.2. Подбор оптимальных условий проведения ПЦРанализа.
2.2.3.3. Проверка таксономической специфичности ПЦР тестсистем 1 и 2 для идентификации ЫеоБрога сашпшп
2.2.3.4. Определение чувствительности ПЦР тестсистем 1 и 2 для идентификации ЫеоБрога сапшит
2.2.4. Разработка контрольных ПЦР позитивных образцов ДНК нового типа в ПЦР тестсистемах Токсоплазма амплитест, Неоспора амплитест
2.2.5. Апробирование ПЦР тестсистемы Токсоплазма амплитест на клиническом и патологическом материале
2.2.5.1. Подбор оптимальной методики выделения ДНК из сыворотки крови, образцов тканей глаз, головного и спинного мозга, сердца, легких, селезенки, почек, мышечной ткани
2.2.5.2. Выявление возбудителя токсоплазмоза методом полимеразной цепной реакции при моделировании острой инвазии на лабораторных животных
2.2.5.3. Выявление возбудителя токсоплазмоза методом полимеразной
цепной реакции в клиническом и патологическом материале от естественно инвазированных животных.
3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ .
4. ВЫВОДЫ.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
7. ПРИЛОЖЕНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Крик опубликовали работу, посвященную структуре ДНК, стало ясно, что основной принцип, лежащий в основе всего живого принцип комплементарности. С этих пор данный принцип стал широко и успешно использоваться для решения проблем, связанных с диагностикой заболеваний, вызываемых различными организмами. До конца х годов реакция гибридизации ДНК с ДНК была основой диагностики. Для проведения этой реакции необходимо было располагать клонированной последовательностью ДНК, которую использовали в качестве молекулярного зонда. Молекулярный зонд представляет собой фрагмент ДНК тестируемого организма, желательно кодирующего синтез одного из факторов патогенности. Использование молекулярного зондирования позволило в значительной степени изменить ряд представлений о диагностике инфекционных и инвазионных заболеваний Бадакшеева А. Г., Кнорре Д. Г., Белохвостов , Щербо С. Н., Макаров В. Б., i , . Было доказано, что тестирование факторов патогенности во многих случаях более информативно по сравнению с исследованием различных фенотипических свойств, которые далеко не всегда отражают корреляционные связи с вирулентностью исследуемого организма Аксенов М. Ю., Гинцбург А. Л., Шагинян И. А., Гинцбург А. Л., . В связи с этим данный подход является мало информативным при диагностике состояний при которых концентрация идентифицируемого организма ниже порога чувствительности метода. Следующим шагом фундаментальной науки молекулярной биологии гена было создание способа исследования поистинс революционизировавшего молекулярную генетику, медицинскую и ветеринарную диагностику, получившего название полимеразной цепной реакции ПЦР рисунок 1. Полимеразная цепная реакция ПЦР была разработана американским биохимиком фирмы . США в г. В г. Нобелевской премией. ПЦР это метод амплификации i vi, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить амплифицировать определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 8 раз Сайки Р. Применение данного метода возможно только при знании полной нуклеотидной последовательности идентифицируемого организма или отдельных ее участков. В основе метода лежит многократное копирование репликация с помощью фермента ДНК полимеразы определенного фрагмента ДНК, который является маркерным для данного вида. Механизм репликации таков, что достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки праймеры, представляющие собой специально химически синтезированные i vi олигонуклеотиды. Рис. Полимеразная цепная реакция ПЦР. ДНК, осуществляемый ДНКполимеразой протекает только между ними. В результате происходит экспотенциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2П , где п число циклов амплификации. Поскольку праймеры входят в состав амплифицируемого фрагмента, его размер определяется числом олигонуклеотидных пар амплифицируемой последовательности и праймера. Обычно размер фрагмента составляет несколько сотен нуклеотидных пар. Полимеразная цепная реакция это циклический процесс, каждый цикл которого включает в себя три этапа, характеризующихся определенной продолжительностью и температурным режимом. Каждый цикл состоит из температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки нуклеотидных цепей с этих праймеров с помощью ДНК полимеразы. Высокая чувствительность. Полимеразная цепная реакция в настоящее время является наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим при необходимости выявлять единичные клетки возбудителей инфекционных, инвазионных заболеваний, незави симо от их природы, даже в тех случаях, когда другими методами иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими, паразитологическими и тому подобное их выявление невозможно. Чувствительность ПЦР тестсистем составляет клеток возбудителя в анализируемой пробе, в то время как чувствительность иммунологических, паразитологических тестов колеблется в пределах клеток.