Ингибиторный анализ роли процессинга ростовых факторов в индукции пролиферации культивируемых клеток

• Автор: Соркин, Александр Давидович
• Шифр специальности: 03.00.17
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Ленинград
• Количество страниц: 161 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений А

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общие сведения о ростовых факторах

2.2. Биологическое действие ЭФР

2.3. ЭФР и его клеточный рецептор

2.4. Процессинг ЭФР

2.5. Исследования роли процессинга ЭФР в индукции пролиферации клеток

2.6. Начальные реакции клеток на ЭФР.

2.7. Фосфорилирование уридина и его стимуляция при действии ЭФР

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Получение и очистка ЭФР, его производных и антител к ЭФР.
3.2. Методы культивирования и остановки пролиферации клеток
3.3. Оценка уровня пролиферативной активности клеточных культур.
3.4. Изучение связывания, кластеризации интернализации
ЭФР флуоресцентными методами
3.5. Изучение связывания, интернализации и деградации ЭФР
3.6. Приготовление и хранение растворов
3.7. Поступление и распределение ДК в клетках ЗТЗ. . .
3.8. Измерение величины в лизосомах
стр.
3.9. Измерение степени поляризации флуоресценции ДФГТ
3 Измерение скорости транспорта и фосфорилирова
ния уридина
3 Описание кинетической модели поступления уриди
на в клетки.
4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ .
4.1. Влияние ингибиторов на индукцию пролиферации
клеток.
4.2. Экспериментальное исследование кинетики поступления уридина в клетки.
4.3. Стимуляция фосфорилирования уридина РФ.
4.4. Действие ингибиторов пролиферации на активацию уридинкиназы .
4.5. Влияние аминов и других ингибиторов на кластеризацию, интернализацию и деградацию ЭФР
4.6. Действие аминов на величину в лизосомах . . .
4.7. Поступление и локализация ДК в клетках ЗТЗ . . .
4.8. Поляризация флуоресценции ДФГТ в мембранных фрагментах и интактных клетках
5. ОБСУЖДЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Постоянные клеточные линии имеют разную степень зависимости размножения от состава базальной среды и содержания в ней сыворотки. Так, клетки минимально трансформированных линий, например ЗТЗ, С3НЮТ12, переходят в состояние покоя б0 при отсутствии или низком содержании сыворотки в среде и начинают активно пролиферировать при внесении в среду свежей сыворотки Никольский, . В настоящее время считается хорошо установленным, что главными компонентами сыворотки, регулирующими активность пролиферации культуры, являются специализированные молекулы ростовые факторы РФ. Исследования механизма действия РФ на клетки привлекают сейчас специалистов из самых различных областей биологии и медицины. Проблема РФ стала точкой пересечения разнообразных гипотез, теорий и методических подходов, приобрела большое теоретическое и практическое значение. К ростовым факторам митогенам относят вещества, как правило полипептидной природы, обладающие способностью стимулировать синтез ДНК пролиферацию клеток непосредственно или в совокупности с другими факторами, действуя в низких меньше 1СГ М концентрациях Никольский, . РФ обладают высокой специфичностью, обеспечиваемой за счет связывания со специализированными клеточными рецепторами. . , , . В настоящее время идентифицировано более десятка ростовых и трансформирующих факторов. В таблице I представлены сведения о молекулярной массе, источнике получения и рецепторах наиболее популярных и хорошо изученных РФ. Рецепторы РФ обнаружены в большинстве типов клеток и тканей млекопитающих С , , . Количество рецепторов варьирует в зависимости от типа клеток, стадии клеточного цикла, степени трансформированности культивируемых клеток. Кд М. I0 см2с1 i . Наличие заякоривания рецепторов элементами цитоскелета и роль цитоскелета в движении рецепторов дискутируется в литературе Васильев, Гельфандт, i, . Повидимому, рецепторы всех РФ, особенно в составе РФрецепторного комплекса, поступают в клетку путем рецепторноопосредованного эндоцитоза , ii, . Эти процессы будут подробнее описаны ниже на примере эндоцитоза ЭФР. Широкая распространенность РФ и их рецепторов в различных тканях млекопитающих свидетельствует о важной роли РФ в обеспечении нормального хода эмбриогенеза, контроле пролиферации клеток взрослого организма, ответе на повреждающие воздействия. Многие нормальные и опухолевые клетки в культуре и i viv обладают способностью секретировать ростовые и трансформирующие факторы в среду . Близкая связь регуляторных механизмов пролиферации и трансформации клеток сейчас уже не вызывает сомнений. Одним из первых серьезных доказательств этой связи было обнаружение гомологии первичной структуры фрагмента фактора роста, выделяемого тромбоцитами ВТФР и белка i вируса рака обезьян i . Это открытие позволило авторам предложить гипотезу о самоетимуляции клеток опухоли посредством экспрессии гена ВТФР. Важнейшее значение для понимания механизмов онкогенеза имела полная расшифровка гена и аминокислотой последовательности рецептора ЭФР, выделенного из клеток линии I и человеческой плаценты, а также установление близкой гомологии в первичной структуре внутриклеточного домена рецептора ЭФР и белка продукта онкогена v . i . Наличие уникальной тирозинкиназной активности у белков продуктов онкогенов и у рецепторов РФ также служит доказательством общности механизмов индукции пролиферации и трансформации клеток ii, , . Известно также, что гены РФ располагаются в тех же участках хромосом человека, что и некоторые онкогены i . ВТФР на клетки сопровождается экспрессией ряда онкогенов i . Таким образом, изучение механизма действия РФ может сыграть важную роль в решении многих теоретических и практических проблем онкологии. Для исследования действия РФ обычно используется такая постановка эксперимента, при которой клетки лишаются РФ и останавливаются в стадии 1, после чего пролиферация клеток стимулируется внесением в среду РФ.