Изучение фенотипической нестабильности генетически трансформированных клеток китайского хомячка

• Автор: Глебов, Олег Константинович
• Шифр специальности: 03.00.17
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Ленинград
• Количество страниц: 352 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.II

1.1. Способы введения чужеродной ДНК

в соматические клетки .

1.2. Системы генселективная среда,1 используемые для выделения генетически

трансформированных клеток

1.3. Особенности процесса генетической

трансформации соматических клеток .

1.4. Гомологичная и незаконная рекомбинация чужеродных молекул ДНК в соматических клетках совместный перенос генов и встраивание
в геном
1.5. Стабильность и причины утраты трансформантного фенотипа соматических клеток
1.6. Экспрессия трансформированных генов
в соматических клетках
1.7. Стабильность экспрессии котрансфор
мированных генов в соматических клетках
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
2.1. Культивирование клеток
2.2. Трансформация клеток китайского
хомячка ТК геном ВПП
2.3. Анализ стабильности ТКфенотипа клеток трансформантных клонов .
2.4. Выделение и анализ субклонов
трансфорлантных клонов .
2.5. Обработка клеток Мит, ТМ и определение устойчивости клеток к Мит и ВДУ .
2.6. Происхождение плазмид, использованных в работе .
с.
2.7. Выделение плазмидных ДНК из клеток .i
2.8. Выделение ДНК из соматических клеток
2.9. Выделение метафазных хромосом и получение ДНК из фракций лизата метафазных клеток
2Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами,
электрофорез и выделение фрагментов ДНК
2Мечение ДНК с помощыо переноса разрывов ДНК полимеразой I из клеток .i или i и гибридизация ДНК
2Трансформация клеток .i гес низкомолекулярной ДНК из клеток транс
форлантного лслона 2I
2Определение активности и изоэлектрическое фокусирование в полиакриламидном геле тимндин киназы
2Статистическая обработка результатов .
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .
3.1. Выделение и характеристика клона А
ТКклеток 1ситайского Хлячка
3.2. Особенности процесса трансформации клеток клона
А8 плазмидными ДНК, содержащими ТК ген ВПП
3.3. Активность ТК в клетках трансформантных клонов.
3.4. Метод различения соматических клеток, экспрессирующих собственную или
вирусную ТК.
3.5. Анализ состояния плазмидных последовательностей во фра циях высоко и низкомолекулярной ДНК клеток трансфорлантных клонов, и спасение экстрахромосомных молекул плазмидных ДНК
3.6. Локализация ТК гена ВПГ1 в клетках
трансфорлантных клонов .
с.
3.7. Стабильность ТКфенотипа клеток
трансформантных клонов .
3.8. Наследуемость нестабильности по ТКфенотипу и стабилизация ТКфенотипа клеток трансформантных клонов .
3.9. Связь потери ТКфенотппа с изменениями в ДНК
3Модель генетической трансформации
соматических клеток
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Слияние клеток с тенями эритроцитов, нагруженными ДНК 3. Ii . ДНК . ДНКфосфат кальция . Шибольшее число работ по трансформации соматических клетокпроведено с использованием Ж гена ВПП или ВПГ2, вводившихся в дефектные по Ж клетки. Трансформантные Жклетки отбирают на селективной среде ГАТ, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. ТК ВПП отсутствие активности ТК ГАТ 0 СоГЬегеi . ТК ВПГ2 ГАТ 0 . ГЕРТ человека кДНК под контролем промотора ранних генов 0В4О отсутствие активности НРТ ГАТ 0 . ДГФР . . . i . . . i . iVi данных . . САмЗелка сирийского хомячка нфосфонацетиль а с партат нет данных iVi . . Трансформирующий ген . Т ВПКРС типа I неспособность клеток к многослойному росту и к росту в полужидком агаре полужидкий агар или отбор фокусов роста 0 v . Трансформирующий ген . Примечание. Клетки обрабатывали преципитатом ДНКфосфат кальция, за исключением трансформации с геном слобелка, которую проводили, сливая клетки с протопластами е. ТШРТ и Ж, соответственно i, , ii, . Жклетки можно, в свою очередь, отобрать из популяции Жклеток на среде, содержащей аналоги тимидана фтордезоксиуридин, ВДГ и др. ГФРТклетки на среде, содержащей аналоги гуанина 8азагуанин, бтиогуалин и др. Возможность двунаправленной селекции как клеток с позитивным, так и клеток с негативным по Ж или ГФРТ фенотипом, давно и широко используется в генетике соматических клеток, в силу чего имеется достаточно большой набор Жклеток и, в особенности, ГФРТклеток. Собственный промотор обеспечивает конститутивную экспрессию Ж гена ВПГ1 , i, , что и обусловливает, повидимому, высокую частоту и эффективность трансформации Жклеток как фрагментами ДНК ВПГ1 и ВПГ2, несущими Ж ген i, , i, , i . . Ж геном i . ii . . Известная первичная последовательность ДНК Ж гена i, . ДНК рестриктазами в регуляторной последовательности гена позволяют с помощью генетической трансформации клеток химерными Ж генами проводить поиск последовательностей ДНК, выполняющих промоторше функции эукариотных генов. Ж ВПГ1 и ВПГ2 отличается от Ж клеток млекопитающих по субстратной специфичности, чувствительности к нагреванию, подвижности при электрофорезе и по изоэлектрической точке i . ii . ТКклеток, отобранных на среде ГАТ. , была сконструирована плазмида, содержащая кДНК гена ГФРТ человека . Высокая эффективность трансформации с клонированным геном ГФРТ, и наличие большого выбора линий ГФРТклеток дают основание предполагать, что трансформация с помощью гена ГФРТ получит столь же широкое распространение, как и трансформация с ТК геном ВПГ1. Вце одна двунаправленная система селекции, используемая для выделения генетически трансформированных клеток, связана с геном АФРТ. АФРТ синтезирует аденинмонофосфат АМФ из аденина, и в присутствии аналогов аденина 2флюороаденина, 2,6диаминопурина, 8азааденина и др. АФРТклетки. Для выделения клеток, экспрессирующих введенный ген АФРТ, в среду добавляют аналог аспарагиновой кислоты аланозин, который, ингибируя аденилосукцинат синтетазу, блокирует превращение инозинмонофосфата ЙМФ в аденилосукциновую кислоту, предшественник АМФ. Выживаемость клеток в этих условиях зависит от наличия АФРТ, восполняющей дефицит АМФ . Эта система селекции позволяет одновременно и независимо проводить селекцию на среде ГАТ, что было использовано при генетической трансформации соматических клеток , x, а . Как следует из табл. ГФРТклеток с геном ГФРТ человека под контролем промотора ранних генов 0В в раз, а эффективность трансформации в 0 раз выше, чем с аналогичным геном из клеток б. КГФРТ, также соединенным с промотором ранних генов .