Исследование чувствительности иммобилизованного ферментативного реагента для экологических биолюминесцентных тестов

• Автор: Торгашина, Ирина Геннадьевна
• Шифр специальности: 03.00.16
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 100 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологическое тестирование в экологическом мониторинге.

1.1.1. Задачи биологического мониторинга

1.1.2. Биологическое тестирование водных объектов.

1.2. Биолюминесцентные биотесты.

1.2.1. Биотесты основанные на светящихся бактериях

1.2.2. Биотесты, основанные на использовании ферментативных

реакций светящихся бактерий.

1.2.3. Характеристика тестобъекта ферментов светящихся бактерий.

1.3. Использование иммобилизованных ферментов в биотестировании.
1.3.1. Методы иммобилизации биолюминесцентных систем
1.3.2. Преимущества и недостатки различных способов иммобилизации биолюминесцентных систем
1.3.3. Гели на основе крахмала и желатина носители для
иммобилизации биолюминесцентной биферментной системы
1.4. Обоснование задачи.
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ.
2.1. Приборы и реактивы.
2.2. Методы получения иммобилизованных ферментов
2.3. Измерение активности биолюминесцентных биотестов.
2.4. Методы определения чувствительности биолюминесцентных биотестов к действию модельных поллютантов и сточных вод целлюлознобумажного комбината
2.5. Определение кинетических параметров биолюминесцентных биотестов.
2.6. Статистическая обработка
результатов.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка биотеста на основе иммобилизованной биферментной системы светящихся бактерий.
3.1.1. Выбор условий иммобилизации биферментной системы НАДНФМНоксидоредуктазалюцифераза
3.1.2. Особенности катализа иммобилизованными ферментами биферментной системы светящихся бактерий.
3.1.3. Зависимость чувствительности иммобилизованной биферментной системы к сульфату меди от состава реакционной шеси
3.1.4. Создание многокомпонентного иммобилизованного реагента
3.2. Подбор условий проведения ферментативного биотестирования с использованием многокомпонентного иммобилизованного реагента
3.2.1. Влияние реакционной смеси на активность ферментативных биолюминесцентных реагентов
3.2.2. Влияние ионной силы реакционной смеси на активность ферментативных биолюминесцентных реагентов.
3.2.3. Влияние температуры на активность ферментативных биолюминесцентных реагентов
3.3. Анализ чувствительности иммобилизованных ферментативных реагентов для экологического биолюминесцентного биотестирования
3.3.1. Подбор методики биолюминесцентного анализа с использованием иммобилизованной биферментной системы
3.3.2. Исследование чувствительности иммобилизованной биферментной системы к действию модельных поллютантов
3.3.3. Исследование влияния сточных вод Енисейского целлюлознобумажного комбината на биолюминесцентную реакцию, катализируемую биферментной системой ПАДНФМН
оксидоредуктазалюцифераза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ ПО ДИССЕРТАЦИИ
ЛИТЕРАТУРА


Однако успех получения такого препарата определяется выбором подходящего носителя и метода иммобилизации. В настоящее время предложено более десятка способов и носителей для иммобилизации ферментов светящихся бактерий КШаьуик, ЕэтЬекоуа, . Среди них наиболее перспективными для получения иммобилизованного реагента для экологических биотестов являются методы включения ферментов в полимерные гели, так как они позволяют создать оптимальное микроокружение для ферментов, и тем самым сохранить их высокую каталитическую активность и обеспечить стабильность препаратов при длительном хранении. В качестве носителей для иммобилизации биферментной системы светящихся бактерий могут быть выбраны гели различной природы желатиновый и крахмальный. Выбор крахмального геля, как полисахарида, обусловлен его нетоксичностью и нейтральностью. В то же время использование желатинового геля, как белкового носителя для иммобилизации биферментной системы, позволяет понять закономерности функционирования ферментов i viv, поскольку многие ферменты в клетке функционируют в тесном контакте с другими ее компонентами, в частности с липидами и белками. Более того, крахмал и желатин являются относительно дешевыми реактивами, а процедура иммобилизации ферментов в гели не трудоемка, что немаловажно с точки зрения коммерциализации полученных реагентов. Все это доказывает, что при иммобилизации люциферазы в гели возможно получение стабильного, удобного в использовании и дозированного реагента, включающего все необходимые компоненты для биолюминесцентных ферментативных биотестов. Необходимым этапом для разработки чувствительных биодатчиков на основе иммобилизованных ферментов НАДНФМНоксидоредуктазалюцифераза и успешного использования разработанных биодатчиков в экологическом мониторинге является исследование влияния полимерной матрицы на активность и чувствительность ферментов, кинетико термодинамические параметры, а также особенности взаимодействия ферментов с субстратами и ингибиторами. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Исследование взаимодействия ферментов и субстратов в гелевом окружении в зависимости от условий иммобилизации для создания многокомпонентного иммобилизованного реагента, предназначенного для ферментативного биотестирования при проведении экологического мониторинга водных систем. Изучение условий иммобилизации биферментной системы светящихся бактерий для разработки реагента, обеспечивающего высокую чувствительность к действию поллютантов. Сравнение ферментсубстратных взаимодействий в иммобилизованной и растворимой биолюминесцентной биферментной системе НАДНФМНоксидоредуктазалюцифераза для понимания условий работы реагента в биолюминесцентных ферментативных биотестах. Сравнение чувствительности растворимого и иммобилизованного реагента к действию антропогенных поллютантов с целью разработки нового ферментативного биотеста с использованием иммобилизованного реагента. НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые изучено взаимодействие ферментов и субстратов при совместной иммобилизации ферментов НАДНФМНоксидоредуктазы и люциферазы и субстратов тетрадеканаль, ФМН и НАДН. Проведено сравнение влияния полимерных носителей различной природы на чувствительность и активность биферментной системы светящихся бактерий. Изучены механизмы стабилизации смесей ферментов и субстратов при смене микроокружения в различных условиях температура, и т. Получены зависимости чувствительности люциферазных биотестов от условий иммобилизации. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Впервые разработан многокомпонентный иммобилизованный реагент для экологических ферментативных биотестов, отличающийся следующими преимуществами простота проведения анализа, высокая стабильность при хранении и использовании, а также при воздействии повышенных температур, экстремальных значений и т. На основе иммобилизованного реагента разработан новый подход для создания ферментативных биотестов для экологического мониторинг а водных экосистем и других видов мониторинга. Метод и реагент пригодны для использования, как в лабораторных, так и в нолевых условиях.