Влияние ионизирующей радиации на уровень полиморфизма ДНК в разных тканях у потомства облученных мышей

• Автор: Ломаева, Милена Гелиевна
• Шифр специальности: 03.00.16
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

1. Обзор литературы

1.1. Спонтанная и индуцированная НСГ

1.2. Трансмиссибельная и трансгенерационная НСГ

1.2.1. НСГ регистрируемая в структурных генах

1.3. Повторяющиеся последовательности ДНК

1.3.1. Классификация повторов

1.3.2. Семейства повторов

1.3.3. Распределение МНС и МКС по геному

1.4. Вариабельность повторов

1.4.1.Спонтанная вариабельность МНС и МКС

1.4.2. Роль МКС и МНС в функционировании организма

1.4.3. Индуцированная вариабельность МКС и МНС
1.5. Трансгенерационный полиморфизм МНС и МКС
1.5.1. Стадии сперматогенеза и оогенеза
1.5.2. Различие стадий сперматогенеза но чувствительности
1.5.3. Различие чувствительности сперматозоидов и ооцитов к ИР
1.5.4. Влияние облучения ИР самцов или самок на их необлученное потомство
1.6. Применение различных методов ПЦР к исследованию
2. Материалы и методы исследования
2.1. Животные
2.1.1 .Характеристика линии ВАЬВс
2.1.2. Содержание животных во время экспериментов.
2.1.3. Облучение животных
2.1.4. Сбор и хранение образцов тканей животных
2.2. Оборудование и материалы
2.2.1 .Оборудование
2.2.2.Ферменты и биопрепараты
2.2.3.Реагенты
2.3. Фенольный метод выделения ДНК
2.4. Препараты для подсчета МЯ в эритроцитах
2.5. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.5.1. Выбор праймера и оптимизация условий ПЦР
2.5.2. Условия ПЦР
2.6. Полиакриламидный вертикальный гельэлектрофорез ПААГ
2.7. Окрашивание гелей с помощью азотнокислого серебра
2.8. Компьютерная обработка изображений
2.9. Статистическая обработка результатов
3. Результаты и обсуждение
3.1. Схемы экспериментов
3.1.1. Схема серии экспериментов по изучению трансгене рационных эффектов острого гаммаоблучения самцов мышей
3.1.2. Схема серии экспериментов по изучению трансгене рационных эффектов острого гаммаоблучения самок мышей
3.2. Влияние облучения на репродуктивные свойства жи вотныхродителей и жизнеспособность их потомства
3.2.1. Плодовитость самок линии ВАЬВс
3.2.2. Жизнеспособность потомства, родившегося до и по еле облучения одного из родителей
3.2.3. Численность потомков в помете и половой индекс
3.3. Полимеразная цепная реакция
3.4. Систематизация первичных данных
3.5. Построение гистограмм распределения
3.6. Полиморфизм длин МКСассоциированных повторов в геномной ДНК у потомков при облучении одного из родителей
3.6.1. Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов ДНК в разных тканях у потомков при облучении одного из родителей
3.6.2. Радиационноиндуцированный полиморфизм длин амплифицированных фрагментов ДНК у потомков при облучении
одного из родителей
3.7. Зависимость степени полиморфизма длин амплифици рованных фрагментов ДНК от пола потомков
3.8. Частота встречаемости МЯ у родителей и потомства до и после облучения самокродителей
3.9. Сравнение уровня НСГ у потомства, рожденного после облучения самок родителей зарегистрированного цитогенетическим и молекулярнобиологическим методами
4. Заключение
5. Литература
6. Приложения
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АТС аномальные головки спермиев ДЛМ доминантные летальные мутации ИР ионизирующая радиация ЛПЭ линейная передача энергии МГЭ мобильные генетические элементы МКС микросателлиты МНС минисателлиты мтДНК митохондриальная ДНК НРП неродительские полосы
НРП число неродительских полос в процентах к ОЧП
НСГ нестабильность генома
ОБЭ относительная биологическая эффективность
ОЧП общее число полос
ПААГ полиакриламидный гель
ПО программное обеспечение
ПЦР полимеразная цепная реакция
РИНГ радиационноиндуцированная нестабильность генома РТ реципрокные транслокации СХО сестринский хроматидный обмен я ДНК ядерная ДНК
ii i i i
x i
i i или i i
iii i
полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
коэффициент электрофоретической подвижности

i
i
V vi
ВВЕДЕНИЕ


Выявить возможные половые отличия в уровне полиморфизма длин МКСассоциированных повторов, определяемом по числу неродительских полос НРП у потомства, рожденного от облученных самцов или самок родителей. Сравнить уровень НСГ, выявляемый по молекулярногенетическим полиморфизм МКС и по цитогенетическим частота встречаемости МЯ маркерам, у потомства самок, облученных ИР в сублетальных дозах. Научная новизна и практическая значимость. Впервые продемонстрирована возможность применения анализа для оценки индуцированной ИР вариабельности длин МКСассоциированных повторов. НСГ потомства, облученных ИР в области сублетальных доз от до 0 сГр самцов и самок мышей линии ВАЬВс методом оценки полиморфизма длин фрагментов ДНК, амплифицированных с праймером из последовательности, фланкирующей МКСлокус на ой хромосоме мышей. Нами обнаружены связанные с типом ткани и полом различия в уровне полиморфизма длин повторов у потомков, родившихся до и после облучения одного из родителей в сублеталыюй дозе 0 сГр. Для обработки результатов впервые было использовано специально разработанное программное обеспечение ПО, позволяющее значительно уменьшить влияние субъективных факторов и сильно ускорить анализ и статистическую обработку большого массива данных. Результаты работы могут быть использованы для экстраполяции данных с целью оценки генетического риска воздействия острого облучения в малых и умеренных дозах на человека. Кроме того, полученные результаты позволяют рассматривать метод АРРСЯ в качестве одного из важных компонентов эффективных систем радиоэкологического мониторинга и расчета экологических рисков. Один из основных инстинктов живой природы стремление к воспроизводству осуществляется благодаря дупликациям генов, которые поддерживают постоянство генома в целом, возмущаемое случайными изменениями мутациями Хесин, . Это позволяет в процессе развития вида воспроизводить какойлибо признак и вносить в него необходимые, при определнных условиях, изменения. Так как под стационарностью любого процесса в природе надо понимать постоянное противоборство двух динамических процессов. Один из которых стремится к увеличению энтропии, а другой к ее уменьшению, что приводит каждый живой организм к некоторому относительно устойчивому положению равновесия. Так и геном лишь относительно стабилен благодаря работе ферментов системы репарации. Любой геном обладает таким свойством как непостоянство, и это свойство, особенно, в присутствии повреждающих факторов проявляется тем сильнее, чем интенсивнее воздействие этих факторов, в частности ИР Сарапульцев, Гераськин Мазурик, Михайлов Нефедов и др. Евсеева и др. Для описания ситуации, когда состояние генома в культивируемых клетках или в клетках организма характеризуется повышенным количеством спонтанных повреждений, высокой частотой мутаций иили темпов мутирования, повышенным уровнем амплификации генов и изменением характера генной экспрессии, широкое распространение получило выражение геномная иногда генетическая нестабильность или нестабильность генома НСГ. Воробцова и др. Заичкина и др. Назаренко, Тимошевский Любимова, Воробцова . На уровне целого организма характерной чертой НСГ является старение . Зайнуллин, Москалев, . Изменчивость генома в популяциях является основой эволюции, разнообразия видов и внутривидового полиморфизма. Открытие мобильных генетических элементов МГЭ в геномах растений и животных i Гвоздев, Георгиев и последующий анализ транспозиций МГЭ Семин, Ильин продемонстрировали, что крупные геномные перестройки вносят большой вклад в спонтанную НСГ. Изменчивость генома, вызванная различными повреждающими агентами и, в частности, ИР, может проявляться непосредственно после воздействия или же в отдаленные сроки Муксинова, Никольская . Среди исследованных отдаленных эффектов ИР одним из наиболее интересных и важных является радиационноиндуцированная нестабильность генома РИНГ. Этому термину различные авторы придают разный смысл. Например, А. Н. Котеров v, Котеров, под РИНГ понимает феномен, заключающийся в повышении вероятности возникновения непредсказуемых дефектов, выявляемых как неклонируемые повреждения генома у потомков облученных клеток. Также А.