Микробные процессы круговорота углерода в донных осадках озера Байкал: структура и функционирование микробных сообществ

• Автор: Земская, Тамара Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.16, 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Иркутск
• Количество страниц: 330 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Материалы и методы исследования

1.1. Районы исследования, используемые пробоотборники

1.2. Методы химического анализа

1.3. Методы микробиологического анализа

1.4. Молекулярномикробиологические методы исследования микроорганизмов ПЦР, клонирование, секвенирование, гибридизация i i

1.5. Измерение скоростей аэробных и анаэробных процессов ГЛАВА 2. Литературный обзор

ГЛАВА 3. Донные осадки озера Байкал среда обитания микроорганизмов

3.1. Геологогеофизические характеристики, влияющие на деятельность микробных сообществ

3.2. Органическое вещество донных отложений озера Байкал

3.3. Газовый состав и газовые гидраты

3.4. Химический состав поровых вод осадков озера Байкал ГЛАВА 4. Численность микроорганизмов в донных осадках Байкала
4.1. История исследования микрофлоры донных осадков на Байкале
4.2. Количественная характеристика культивируемых и некультивируемых микроорганизмов, обитающих в донных осадках ГЛАВА 5. Аэробные процессы, осуществляемые микробными сообществами в донных осадках озера Байкал
5.1. Численность и активность микроорганизмов,
осуществляющих аэробные процессы деструкции органического вещества
5.2. Нефтеокисляющие микроорганизмы в районах
естественного выхода нефти пространственное распределение, наличие генов алкангидроксилаз
5.3. Бактериальное окисление метана
5.4.Численность, морфология и таксономический состав метанотрофных бактерии в Байкале
5.5. Анализ аэробного метанотрофного сообщества озера Байкал, методом анализа фрагментов гена Б рРНК и гена
мембрансвязанной метанмонооксигеназы ртоА
ГЛАВА 6. Деятельность анаэробных микроорганизмов в донных отложениях озера Байкал процессы ацетогенеза,
сульфатредукции, мстаногенеза
6.1. Численность анаэробных культивируемых микроорганизмов, участвующих в деструкции органического вещества в осадках озера Байкал
к
6.2. Микроорганизмы, осуществляющие процессы ацетогенеза и сульфатредукции
6.3. Скорости процесса метаногенеза в донных отложениях озера Байкал
6.4. О возможном анаэробном окислении метана в пресноводном Байкале
ГЛАВА 7. Микробные сообщества осадков в районах субаквальных разгрузок
7.1. Процессы и филогенетическая структура микробных сообществ в районах грязевых вулканов
7.2. Микробные маты в районе гидротермального подводного источника в б. Фролиха
7.3. Микробные сообщества осадков, сформированных в различные временные периоды голоцене и плейстоцене ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Чистили методом электроэлюции и растворяли в мкл безбактериальной воды. Секвенировапие фрагментов генов, В некоторых случаях для выявления идентичных клонов предварительно проводили однобуквенное секвенирование Денисова и др. Р АТФ. Реакцию проводили с пмолями праймера 0 и . Условия реакции циклов С 2 мин 1 цикл, С 1 мин, С 1 мин, С 1 мин 2 циклы. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 7 полиакриламидном геле, содержащим 8 М мочевину, и визуализировали авторадиографией. Клоны, различающиеся по картинам однобуквенных сиквенсов, секвенировали с помощью автоматических секвенаторов нуклеиновых кислот и 3 , США. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили путем поиска гомологичных последовательностей в трех банках данных , и с помощью программы . СЬиБТАЬ У. Для построения эволюционных деревьев использовали пакет программ ТгееСопУ версия 1. Для исследования микробного сообщества, основу которого составляют бесцветные серные бактерии, был применен денатурирующий градиентный гельэлектрофорез ДГГЭ. Метод денатурирующего градиентного гельэлектрофореза основан на зависимости свойств плавления или денатурации небольших двухнитевьтх молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее от соотношения АТ и вС пар в исследуемых фрагментах Робс1е, Ьоэекоо . Объясняется это тем, что вС связь более прочная по сравнению со связью между нуклеотидами А и Т. Подобные различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухнитиевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях. Градиент денатурации достигается разницей температур, различной концентрации мочевины или формальдегида в гелях. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют поразному. Разработан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказывать характер плавления в зависимости от нуклеотидной последовательности Ьегтап, БИуеет, . При электрофорезе амплифицированных двухнитиевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквивалентной температуре плавления Тт, то есть такой температуре, при которой каждая пара оснований с ой вероятностью может соединиться или разойтись. После начала плавления продвижение двухнитиевого фрагмента ДНК в геле резко замедляется вследствие сложной пространственной конфигурации молекул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Таким способом удается идентифицировать лишь около однонуклеотидных замен в
фрагментах ДНК длиной от до нескольких сотен нуклеотидов. Связано это с тем, что при прохождении ДНК через гель может начаться частичная денатурация концов молекул еще до достижения оптимальной области плавления. Поэтому мутации, локализованные вблизи концов амплифицированных участков ДНК, оказывают меньшее влияние на процесс плавления и поэтому могут не выявляться. Эффективность обнаружения мутаций с помощью градиентного денатурирующего электрофореза может быть существенно повышена за счет присоединения к концам амплифицированной геномной ДНК синтетических фрагментов вСнуклеотидов, длиной в несколько десятков пар оснований. Такие монотонные тугоплавкие концы выполняют роль своеобразных зажимов и резко увеличивают шансы обнаружения для всех точечных мутаций, независимо от их локализации внутри исследуемого фрагмента ДНК. Эта модификация делает метод очень чувствительным. Он пригоден для более крупных амплифицированных фрагментов ДНК. При исследовании фрагментов до 0 п. К недостаткам метода следует отнести техническую сложность получения равномерного градиента денатурирующего агента в полиакриламидном геле, а также высокую стоимость искусственно синтезированных ОС концов. В эксперименте использованы следующие реагенты. Формамид, деиониз. Вода бидист.