Идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы

• Автор: Кузнецова, Екатерина Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Роль эпигенетики в изучении патогенеза рака молочной железы и

разработке молекулярных маркеров канцерогенеза.

1.1.1. Краткая характеристика рака молочной железы

1.1.2. Значение метилирования ДНК в норме и при патологии.

1.1.3. Особенности метилирования СрСостровков генов, вовлеченных в канцерогенез

1.1.4. Значение нарушений метилирования ДНК при РМЖ как молекулярных маркеров канцерогенеза

1.1.4.1. Аномальное метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез,

при РМЖ.

1.1.4.2. Преимущества метилирования ДНК как молекулярного маркера

канцерогенеза.
1.1.4.3. Аномальное метилирование ДНК в биологических жидкостях
при РМЖ.
1.2. Методы анализа метилирования ДНК.
1.2.1. Методы исследования полногеномного метилирования.
1.2.2. Генспецифический анализ метилирования.
9 1.2.2.1. Основные принципы генспецифического анализа метилированияЗЗ
1.2.2.2. Выбор метода генспецифического анализа метилирования.
1.2.3. Методы поиска дифференциально метилированных СрОостровков
1.2.3.1.Метилчувствительное рестрикционноориентированное геномное сканирование.
1.2.3.2. Метилчувствительный репрезентативнодифференциальный анализ МЧРДА.
1.2.3.3. Вычитательная гибридизация хромотографически изолированных пулов СрСостровков
1.2.3.4. Метилчувствительный фингерпринтинг МЧФП.
1.2.3.5. Амплификация интерметилированных СрСостровков
1.2.3.6. Идентификация дифференциально метилированных СрСостровков
с использованием микрочиповых технологий
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Клинический материал.
2.2. Забор крови и операционного материала.
2.3. Выделение геномной ДНК
2.4. Выделение РНК.
2.5. Модификация метода МЧФП.
2.5.1. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции.
2.5.2. Метилчувствительная полимеразная цепная реакция МЧПЦР с использованием ССбогатых праймеров
2.5.3. Электрофорез в ПААГ.
2.5.4. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра
2.5.5. Амплификация фрагментов СрСостровков и определение
нуклеотидной последовательности.
2.6. Рестрикционный анализ.
2. 7. Метилчувствительная ПЦР со специфическими праймерами
2. 8. Обработка ДНК бисульфитом натрия
2. 9. Метилспецифический сиквенс
2 Синтез кДНК
ф 2 ОТПЦР в реальном времени.
2 Микросателлитный анализ
2 Программное обеспечение
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Оптимизация метода поиска аномально метилированных СрСостровков.
3.2. Идентификация дифференциально метилированных СрСостровков
в образцах ДНК больных РМЖ.
3.3. Характеристика метилирования исследуемых генов в нормальных
тканях человека.
3.4. Анализ метилирования и экспрессии исследуемых генов
в образцах опухолей РМЖ
3.4.1. Анализ метилирования и экспрессии гена ВШ
3.4.2. Анализ метилирования и экспрессии гена ЬАМСЗ
3.4.3. Анализ метилирования и экспрессии гена 5ЕМА6В.
3.4.4. Анализ генов, кодирующих субъединицы ионных каналов.
3.4.5. Анализ метилирования и экспрессии гена УС1Р
3.4.6. Анализ метилирования и экспрессии гена Г
3.5. Оценка эффективности модификации метода МЧФП и информативности выявленных эпигенетических маркеров канцерогенеза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АА акриламид
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
ДВЖХ денатурирующая высокоразрешающая жидкостная хроматография ДИ доверительный интервал МСПЦР метилспецифическая ПЦР
МСДГТЭ метилспецифический денатурирующий градиентный гельэлектрофорез МСД метилсвязывающий домен МЧПЦР метилчувствительная ПЦР
МЧРДА метилчувствительный репрезентативнодифференциальный анализ
МЧФП метилчувствительный фингерпринтинг
МСсиквенс метилспецифический сиквенс
ОТПЦР полимеразная цепная реакция с обратных транскриптов
ПААГ полиакриламидный гель
ПГ потеря гетерозиготности
ПДРФ полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
ПК протеинкиназы
п.н. пара нуклеотидов
ПЦР полимеразная цепная реакция
РМЖ рак молочной железы
т.п.н. тысяча пар нуклеотидов
ЭДТА натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты аммония персульфат
комбинированный бисульфитрестрикционный анализ
циклинзависимые киназы
дезоксицитидинтрифосфат
дизоксинуклеотидтрифосфат
дезокситимидинтрифосфат
фосфатный буфер
додецилсульфат натрия
ББС статдартный солевой раствор 0, М хлорид натрия, 0,5 М цитрат натрия
ББСР метод анализа конформации однонитевых фрагментов
ТВЕ трисборатный буфер шМ трисборат, шМ борная кислота, 2 шМ ЭДТА
ТЕ шМ трисНС1, 8.0,1 шМ ЭДТА
ТЕМЕЭ тетраметилэтилендиамин
Аббревиатуры генов и их белковых продуктов, а так же сокращения распространнных единиц измерения даны в соответствии с общепринятыми номенклатурами.
ВВЕДЕНИЕ


Оценка эффективности модификации метода МЧФП и информативности выявленных эпигенетических маркеров канцерогенеза. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. ТЕ шМ трисНС1, 8. Аббревиатуры генов и их белковых продуктов, а так же сокращения распространнных единиц измерения даны в соответствии с общепринятыми номенклатурами. ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Основными задачами онкогеномики являются изучение молекулярных механизмов канцерогенеза и разработка оптимальных методов предупреждения, диагностики и мониторинга онкологических заболеваний. В связи с этим особое значение приобретает проблема идентификации генов, вовлеченных в канцерогенез, и их подробная характеристика. Один из подходов к решению этой задачи основывается на анализе эпигенетических особенностей генома опухолей. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов подразумевает изменения генома, отличные от структурных вариаций кодирующих областей генов. К эпигенетическим явлениям относятся, в частности, метилированиедеметилирование ДНК и гистонов, ацетилированиедеацетилирование гистонов, полиморфизмы повторяющихся последовательностей в регуляторных областях генов. В настоящее время разработан ряд методов, позволяющих выявлять аномально метилированные локусы в геноме опухолевой клетки. Идентифицированные с помощью подобных методов гены в дальнейшем характеризуются с точки зрения их молекулярной патологии при канцерогенезе, в частности, оценивается их экспрессия, структурные нарушения и метилирование в норме и патологии. Особое внимание целесообразно уделять подробной характеристике особенностей метилирования изучаемых генов. Это обусловлено тем, что анализ маркеров метилирования на сегодняшний день является оптимальным инструментом молекулярногенетической диагностики и мониторинга в онкологии. По специфичности он не уступает анализу экспрессии генов, значительно превосходя последний по простоте и доступности. Что же касается анализа структурных аномалий, он остается достаточно дорогостоящей процедурой и находит применение, в основном, в диагностике наследственных онкологических синдромов. Анализ аномалий метилирования должен опираться на фундаментальную научную основу. В частности, необходимо значительно расширить генный состав применяемых диагностических панелей. Список хорошо изученных диагностических и прогностических маркеров метилирования не превышает на сегодняшний день двух десятков, причем многие из них не являются специфичными. Срвостровков в норме и при патологии. Злокачественные новообразования относятся к одним из наиболее социально значимых болезней. Использование в клинической практике высокоинформативных предиктивных, диагностических и прогностических молекулярных маркеров канцерогенеза должно способствовать формированию групп риска, раннему выявлению заболеваний, повышению эффективности дифференциальной диагностики, определению тактики лечения и контролю за его эффективностью. Существующие панели молекулярногенетических маркеров канцерогенеза не обеспечивают необходимого уровня эффективности диагностики, что объясняется, в первую очередь, недостатком всесторонне изученных маркеров. На сегодняшний день одним из оптимальных инструментов молекулярногенетической диагностики и мониторинга в онкологии является анализ маркеров метилирования. Тем не менее, выбор таких маркеров часто проводится на случайной основе без учта эпигенетических характеристик конкретных геномных локусов. Совершенствование молекулярногенетической диагностики онкозаболеваний невозможно без идентификации новых генов, вовлечнных в канцерогенез, и подробной характеристики особенностей эпигенетической регуляции их функционирования в норме и при патологии. Целью настоящей работы является идентификация и характеристика новых маркеров метилирования и экспрессии генов, вовлеченных в канцерогенез, при раке молочной железы. Оптимизация методологии скрининга дифференциального метилированния геномов нормальных и опухолевых клеток. Идентификация локусов генома человека, аномально метилированных в образцах РМЖ и определение их принадлежности к конкретным генам.