Исследование метилирования ряда генов, вовлеченных в канцерогенез, в различных типах опухолей

• Автор: Землякова, Валерия Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Метилирование ДНК

1.1.1. Количество и распределение динуклеотидов Ср в геноме.

1.1.2. Профили метилирования.

1.1.3. Ферменты метилирования

1.1.4. Метилирование генома как динамический процесс.

1.1.5. Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина

1.1.6. Методы анализа метилирования ДНК

1.2. Молекулярногенетические механизмы канцерогенеза.
1.2.1. Гены, вовлечнные в канцерогенез
1.2.2. Генысупрессоры опухолевого роста.
1.2.3. Гены, регулирующие клеточный цикл.
1.2.4. Метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез.
1.2.5. Метилирование ДНК, как характеристика опухолевого процесса
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Клинический материал.
2.2. Забор крови и операционного материала
2.3. Выделение геномной ДНК
2.4. Рестрикционный анализ.
2.5. Метилчувствительная ПЦР МЧПЦР.
2.6. Обработка ДНК бисульфитом натрия
2.7. Метилспецифическая ПЦР МСПЦР
2.8. Электрофорез в ПААГ
2.9. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра
2 Определение нуклеотидной последовательности
2 Программное обеспечение.
2. Статистическая обработка данных
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Метилирование исследуемых генов в нормальных тканях
3.2. Сравнение метилирования исследуемых генов в различных типах опухолей
3.3. Аномальное деметилирование гена ЮГ2 при разных типах опухолей
3.4. Характеристика гипотетического метилотипа при НМРЛ, РМЖ, ретинобластоме и ОЛ.
3.5. Исследование аномального метилирования локуса ШК4аЛЯР на примере СрСостровков, расположенных в промоторных областях генов р6 и рАЯР.
3.6. Исследование ассоциации метилирования промоторных областей изучаемых геновсупрессоров опухолевого роста с клиническими параме трам и опухолей НМРЛ, ретинобластомы и ОЛ.
3.6.1. Ассоциации метилирования с клиникопатологическими
характеристиками образцов НМРЛ
3.6.2. Ассоциации метилирования с клиникопатологическими характеристиками образцов ОЛ.
3.6.3. Ассоциации метилирования с клиникопатологическими характеристиками образцов ретинобластомы
3.6.4. Ассоциации метилирования с клиникопатологическими характеристиками образцов РМЖ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Целью настоящей работы является характеристика аномального метилирования островков ряда генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла и канцерогенез в образцах опухолей, имеющих различное тканевое происхождение. Задачи исследования. Разработать эффективные методики определения метилирования промоторных районов исследуемых геновсупрессоров опухолевого роста на основе метилчувствитсльной и мстилспецифической ПЦР, провести их сравнительный анализ. Охарактеризовать метилирование промоторных районов генов I, 62, 2, 4, 1, , , I1, , I и при нсмелкоклеточном раке легкого 1, раке молочной железы РМЖ, ретинобластоме и острых лейкозах ОЛ. Определить характер метилирования динуклеотидов островков, расположенных в промоторных и регуляторных областях генов 4 и i 62, л оку са р . Выявить возможные ассоциации между метилированием островков конкретных генов, интенсивностью метилирования всей панели из исследуемых генов I, 62, р 52, р , 1. , , , I1, и клиникоморфологическими характеристиками изучаемых опухолевых образцов. Охарактеризовать частоту потери импринтинга в результате деметилирования промоторной области гена I2 в исследуемых типах опухолей. Научная новизна. В результате проведенного исследования изучено аномальное метилирование генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла и канцерогенез I, 62, 2, р , 1, , , 11, . I. и I2 при РМЖ, I, ретинобластоме и I. Показано, что в разных типах опухолей характер метилирования исследуемых генов различен. В образцах ОЛ выявлена наименьшая интенсивность метилирования панели исследуемых генов по сравнению с другими изучаемыми типами опухолей Р0. Показано, что при НМРЛ, РМЖ и ретинобластоме уровень метилирования геновр 1 и I1 достоверно выше, чем при ОЛ Р0. Гены и р достоверно чаще метилированы при НМРЛ и РМЖ, чем при ОЛ РЮ. В образцах НМРЛ частота метилирования гена статистически достоверно выше, чем в остальных типах опухолей Р0. Гены, характеризующиеся повышенной частотой метилирования в опухоли определенного типа, дополнили гипотетический метилотии для НМРЛ, РМЖ, ретинобластомы и ОЛ, составленный на основе данных литературы. Показано, что в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров аномальное метилирование изучаемых генов практически отсутствует. Исследован характер метилирования генов 62 и 4 в локусе 9р. Используя МЧПЦР, МСПЦР и МСсеквенирование, определена большая чувствительность метода МЧПЦР, по сравнению с МСПЦР. Изучены возможные ассоциации между интенсивностью метилирования используемой панели генов и клинико морфологическими параметрами опухоли при I, ретинобластоме и ОЛ. Не обнаружено ассоциации метилирования исследуемых генов с такими клиническими параметрами заболевания, как возраст, пол, количество бластных клеток в периферической крови больных и осложнениями заболевания рецидив, смерть при ОЛ. Не было выявлено достоверных различий метилирования исследуемых генов в группах больных с односторонней и двухсторонней формами РБ. Не определено достоверных различий метилирования исследуемых генов в морфологически различных типах НМРЛ. Впервые показано, что гены 1 и р Р0. Р0. НМРЛ. Впервые выявлена ассоциация метилирования генар с наличием метастатического процесса Р0. Установлено, что интенсивность метилирования панели изучаемых генов, которую отражает ИМ, коррелируют с наличием метастатического процесса Р0. НМРЛ Р0. Практическая значимость. Исследовано образцов острых лейкозов, образцов немелкоклеточного рака легкого, образцов ретинобластомы, образцов рака молочной железы в целях определения метилирования промоторных районов генов. Разработаны методики мультилокусной метилчувствительной ПЦР для оценки метилирования промоторных областей каждого из исследуемых генов. Проведен сравнительный анализ методов МЧПЦР и МСПЦР, и показана большая чувствительносить метода МЧПЦР. Выявлено, что потеря импринтинга гена I2 может являться молекулярным маркером опухолевого процесса при НМРЛ, РМЖ, ретинобластоме и ОЛ.