Сравнительное исследование экспрессии бактериальных генов полиглюкангидролаз в растениях

• Автор: Абдеев, Рустам Муратович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Полиглюкаигидролазы

1.1 Классификация полиглюкангидролаз

1.2 Бактериальные полиглюкаигидролазы

1.3 Зглюканазы растений

2. Характеристика выбранных для

исследования термостабильных р люканаз

2.1. Эцдоглюкаваза СсЕ СохШит ЖегтосеИит

2.2. Эндоглюканаза ЬсВ СЬпит Негтосеит

2.3. Эидоглюкаиаза БатА ТИегтаЩа. пеароШапа

3. Клеточная стенка растений как основной
субстрат для Рглюка и аз
3.1. Строение клеточной стенки растений
3.2. Формирование и рост клеточной стенки
3.3. Клеточная стенка как носитель информации
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Модификация последовательности бактериального гена целлюлазы
с целыо успешной зксирессии в рас тениях
1.1 Анализ нуклеотидной последовательности
1.2 Получение делеционных вариантов целлюлазы
1.3 Биохимическая характеристика делеционных вариантов
2. Получение трансгенных расгеннй табака, экспрессирующих
молнфниировлнную бактериальную целлюлазу
3. Сравнительная характеристика трансгенных растений, экспрессирующих различные эндорглюканазы
3.1 Синхронизация всех линий трансгенных растений
3.2 Фенотипическое описание трансгенных растений
3.3 Фитогормональный статус трансгенных растений
3.4 Характеристика формы клеток трансгенных растений
3.5 Анализ клеточной стенки трансгонных растений
3.6 Определение состава сахаров в трансгсиных растениях
ГЛАВА 1У.ОБСУЖДЕНИЕ
1. Модификация последовательности бактериального
гена целлюлазы с целью успешной экспрессии в растениях
2. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих
модифицированную бактериальную пеллюлазу
3. Сравнительная характеристика трансгеннмх растений, экспрессирующих различные эндо3глкжаназы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Клонирование соответствующего гена путем отбора нужного активного клона из библиотеки кДНК каждого вида растения. Создание трансгенных растений, экспрессирующих гены полнглюкангидролаз растений под контролем известных регуляторных элементов. Создание растениймутантов но генам, кодирующим соответствующую глюканазу, и изучение этих растений. Изучение профиля экспрессии интересующих генов растительных полнглюкангидролаз при воздействии на растение различными экзогенными факторами. Экспрессия гетерологнчиых генов полнглюкангидролаз в растениях. Предложено несколько моделей участия Рглюканаз в жизнедеятельности растений. Одним из механизмов, посредством которого Рглюканазы могут осуществлять свои физиологические иили защитные функции, является высвобождение регуляторных молекул олигосахарннов из клеточной стенки либо самого растения, либо фитопатогена. Несмотря на обилие полученных результатов, относительно участия Рглюканаз в физиологических и защитных процессах растений, молекулярные механизмы функционирования этих ферментов в процессах жизнедеятельноеги растений остаются еще не полностью выясненными. Не выявлено, какие сигналы при индуцированной активации растительных 3глюканаз могут осуществлять взаимосвязь с другими метаболитами растительной клетки. Понимание роли 1глюканаз в процессах роста и развития растений затруднено еще и по той причине, что в растениях обнаружено несколько нзоформ ферментов, которые отличаются клеточной локализацией и индуцибельностыо, что затрудняет определение активности исследуемой изоформы фермента на фоне остальных растительных эндорглюканаз i, . Существует ряд подходов к решению вышеуказанной проблемы. Один из них экспрессия в растениях бактериальных генов термостабильных глюканаз с активностями, аналогичными растительным ферментам, и максимальными при высоких значениях температуры, когда вес растительные ферменты инактивируются. В пользу такого подхода, а именно создания модельных трансгенных растений, экспрессирующих термостабильные глюканазы, свидетельствуют данные, полученные в нашей лаборатории ранее Пирузян и др. В качестве рабочей гипотезы нами было выдвинуто предположение, что экспрессия в растениях генов бактериального происхождения, которые кодируют ферменты с активностями, аналотчными или близкими к растительным ферментам, может имитировать действие растительных белков, что позволит моделировать отдельные этапы метаболизма. Ранее в нашей лаборатории были получены трансгенные растения, экспрессирующие бактериальные гены термостабильной эндобета 1,3глюканазы и эндобета1,31,4глюканазы Мовсесян, и др. Были отобраны трансгенные растения, в геноме которых присутствует одна копня соответствующего гена. Доказано, что в растениях экспрессируются соответствующие ферменты с сохранением активности, термостабильносги, субстратной специфичности. Помимо этого показано, что при экспрессии бактериальных генов в растениях не происходит их модификации. Был сделан вывод о возможном изменении фитогормонального баланса в трансгенных растениях, экспрессирующих бактериальный ген эндобета1,3глюканазы. Целью настоящей работы является, вопервых, получение трансгенных растений табака, экспрессирующих бактериальный ген эндор1,4глюканазы, и, вовторых сравнительное исследование экспрессии грех бактериальных генов эндор1,3глюканазы, эндор1,4глюканазы и эндоР1. Провести анализ последовательности и модификацию бактериального гена целлюлазы с целью успешной экспрессии в растениях. Провести сравнительное изучение биохимических свойств модифицированного и полноразмерного фермента. Сконструировать экспрессномные вектора, в которых бактериальный ген термостабильной целлюлазы находится под контролем различных регуляторных элементов, получить и отобрать для дальнейших исследований трансгенные растения табака. Провеет сравнительное исследование молекулярных и физиологобиохимических особенностей трансгенных растений табака, экспрессирующих бактериальные полиглюкангидролазы с различной субстратной специфичностью.