Генетический контроль биосинтеза хлорофилла b у одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii

• Автор: Никулина, Карина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 148 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Список сокращений, принятых в работе.

РАЗДЕЛ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Биосинтез хлорофилла и его генетический контроль

1.1.1 Биосинтез баминолевулиновой кислоты

1. 1. 2 Серия реакций от АЛК до иротонорфирина IX

1.1.3 Включение магния в молекулу протопорфирина IX

1. 1. 4 Серия реакций от УПП IX до протохлорофиллида

1.1.5. Образование хлорофиллида а и хлорофилла а

1. 1.6 Биосинтез хлорофилла Ь

1. 1. 6. 1 Образование хлорофилла Ь из хлорофилла а
1. 1. 6. 2 Образование хлорофилла Ь из хлорофиллида а
1. 1.6. 3 Образование хлорофилла Ь из хлорофиллида Ь
1. 1.6.4 Доказательство существования протохлорофиллида Ь т ууо
1. 1. 6. 5. Образование хлорофиллида Ь из протохлорофиллида
1. 1.6. 6. Происхождение кислорода в молекуле хлорофилла Ь
1. 1. 6. 7. Превращение хлорофилла в хлорофилл а
Глава 2. Общая характеристика структуры и функций комплексов фотосинтстичсского аппарата, в состав которых входит ХЛ Ь
1. 2. 1 Светособирающий ХЛ аЛбелковый комплекс ФС I
1.2.2 Светособирающие антенны ФС II
1. 2. 2. 1 Свстособирающий ХЛ Дьбслковый комплекс ФС II
1. 2.2. 1. 1 Струкура ССК П
1. 2. 2. 1. 2 Функции ССК II
1.2. 2. 2 Биогенез ССК II
1. 2. 2. 3 Светособирающие комплексы СР, СР и СР
1. 2. 2. 4 Светособирающий ХЛ белковый комплекс СР
1. 2. 3 Светособирающий ХЛ а6сгбслковый комплекс
1.2.4 Свстособирающий ХЛ о6белковый комплекс прохлорофитов
ГЛАВА 3. Мутанты высших растений и зеленых водорослей, лишенные хлорофилла
1. 3. 1 Мутанты высших растений
1. 3. 2 Мутанты С. iii
1. 3. 2. 1 Характеристика гена I
1. 3. 2. 2 Влияние ядерных и хлоропластных генов, контролирующих
биогенез хлоропласта, на проявление мутантной атлсли
1. 3. 2. 3 Характеристика гена ГЛАВА. 4 Зеленая водоросль С. iii
молельный объект генетики фотосинтеза
РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2. 1 Исходный генетический материал
2. 2 Условия культивирования штаммов
2. 3 Проведение опытов по мутагенезу
2. 4 Г ибридологический анализ
2.4.1 Постановка скрещиваний
2. 4. 2 Тетрадный анализ
2. 4. 3 Метод случайной выборки зооспор
2. 4. 4. Определение типа спаривания
2. 4. 5 Получения вегетативных диплоидных клеток
2. 5 Определения объема клеток
2. 6 Метод реплик
2. 7 Регистрации фенотипических признаков
по уровню флуоресценции
2. 8 Флуоресцентный анализ
2. 9 Методы выделения и анализа пигментов
2. 9. 1 Экстракция пигментов
2. 9. 2 Анализ пигментов методом ВЭЖХ
2. 9. 3 Спсктрофотомстричсский анализ пигментов
2. 9. 4 Расчет содержания пигментов
2. 9. 5 Разделение имнтов метолом тонкослойной хроматографии
2. Выделение и анализ белков ССКII
2. Выделение и анализ светособирающих комплексов ФС
2. Подготовка и проведение трансформации
2. . I Характеристика плазмиды
2. . 2 Выделение плазмидной ДНК
Приготовление автолшина
2. .4 Протокол трансформации
2. Определение содержания тотальной ДНК у диплоидных клеток
2. Выделение и анализ РНК
2. . I Выделение тотальной РНК
2. . 2 Нозернблотгибридизация
2. Статистические методы
РАЗДЕЛ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1 Получение ревергянтов от мутантов, лишенных ХЛ
3. 1. 1 Скрининг Петергофской генетической коллекции
3. 1. 2 Индукция ревертшггов от мутантов по гену 1
3.1.3 Спопташюе реверсирование мутантов по гену 1
3. 2 Фенотипическое описание рсвертантов
3.2.1 Изучение пигментного состава
3. 2. 2 Изучение переноса энергии между хлорофиллами а и
3. 2. 3 Анализ белков хлорофилл аЛбелкового свстособирающсго комплекса второй фотосистемы у различных штаммов С. iiii
3. 2. 4 Восстановление хлорофилл абслкового свстособирающего комплекса второй фотосистемы у ревертанта 9
3. 3 Г ибридологический анализ рсвертантов
3.3.1 Характер наследования реверсий ЮЗ
3. 3. 2 Обнаружение супрессорных мутаций
3. 3. 3 Изучение аллельной специфичности супрессии
3. 3. 4 Самостоятельный фенотипический эффект
супрессорных мутаций
3. 4. Анализ содержания мРНК гена в различных штаммах С. iii
3.5. Трансформация вегетативных диплоидных
клеток С. iiii
3. 5.1 Получение вегетативных диплоидов, несущих пигментные мутации в гетерозиготном состоянии
3. 5. 2 Выбор плазмиды для трансформации
3. 5. 3 Выбор концентрации антибиотика зеомицина для экспериментов по трансформации диплоидов С. гетЫгпкИ
3.5.4 Выбор оптимального времени воздействия автолизина на диплоидные клетки С. тпИагЖп
3. 5. 5 Получение ядерных трансформатов
3. 6 Результаты инссрционного мутагенеза
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Цель работы заключалась в изучении генетического контроля биосинтеза хлорофилла С. Получить ревертанты от мутантов, лишенных хлорофилла Ь. Дать фенотипическую характеристику полученным ревертантам. Провести гене тический анализ ревертантов. В результате нашей работы было получено и проанализировано спонтанных и химически индуцированных ревертантов от трех мутантных аллелей гена 1. Методом генетического анализа показано, что восстановление биосинтеза хлорофилла Ь у ревертаггов происходит за счет одиночных ядерных мутаций в гснахсупрсссорах. Обнаружена мутация в генссупрсссорс 9, самостоятельный фенотипический эффект которой заключается в повышенном, по сравнению с диким типом, накоплении хлорофилла Ь и специфического ксантофилла лороксантина. Супрессия за счет доминантных мутаций в генах 9, и не является аллелоспецифичной. Таким образом, обнаружено несколько генов, продукты которых по всей видимости играют регуляторную роль в биосинтезе хлорофилла Ь. На основании отсутствия аллельной специфичности супрессии можно выдвинуть предположение о возникновении альтернативного пути биосинтеза хлорофилла Ь у реверташов. Нами разработан новый способ трансформации вегетативных диплоидов одноклеточной водоросли хламидомонады, эффективность которого в два раза выше по сравнению с классическим методом гетерологичной трансформации гаплоидных клеток i, . В результате инсерционного мутагенеза гетерозиготных диплоидов получены трансформанты с предположительным включением плазмидной ДНК в район гена . Список сокращений, принятых в работе. Остальные сокращения объяснены в тексте диссертации. РАЗДЕЛ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. Биосинтез хлорофилла и его генетический контроль. Хлорофилл относится к порфиринам циклическим тстрапирролам. Молекулярные механизмы биосинтеза хлорофилла достаточно хорошо изучены i . К настоящему времени идентифицировано большинство промежуточных продуктов цепи биостгтсза хлорофилла, но. Биосинтез хлорофилла в клетке реализуется посредством большого числа биохимических реакций, которые можно сгруппировать вокруг нескольких узловых точек Рис. Путь биосинтеза хлорофилла в растительной клетке во многом был выяснен благодаря изучению пигментных мутантов одноклеточной зеленой водоросли i, , но генетический контроль этапов биосинтеза хлорофилла оставался неизвестным, так как гибридологический анализ у невозможен. Генетика регуляции биосинтеза хлорофилла активно изучается на пигментных мутантах С. За последние годы был достигнут значительный прогресс по выявлению генов и ферментов, участвующих в биосинтезе хлорофилла а и его предшественников i. В свете этих результатов наиболее приорететной задачей представляется выяснение пути биосинтеза хлорофилла X1 Ь и ею генетического контроля i . Биосинтез 5аминолевулимовой кислоты. Наиболее ранний предшественник хлорофилла, который был точно идентифицирован аминолевулиновая кислота I. У высших растений и некоторых водорослей в том числе и имеет место так называемый С5пуп биосинтеза I из 5ти углеродною скелета глутаминовой кислоты i, . Рис. Генетический контроль биосинтеза хлорофилла у С. НапШ КепЬоФе ВспЬоЬс. Ттко, . Красными буквами обозначены ядерные гены, контролирующие биосинтез хлорофилла, зелеными хлоропластные гены. Светлые стрелки реакция проходит на свету, темные реакция проходит в темноте. Показано, что первым этапом последовательности реакций, ведущих к образованию АЛК по С5пути у С. Рис. Кишат . У С. Эта реакция катализируется глутамилЧРНКсинтстазой. Ядсрный ген, кодирующий этот фермент, до сих пор не выделен ни у высших растений ни у зеленых водорослей . Рис. Схема биосинтеза аминолевулиновой кислоты i . РНКредуктазой до глутамат1семиальдегида
ГСА с высвобождением . Этот этап контролируется геном НЕМА, который клонирован у бактерий и высших растений . Следующий этап превращение ГСА в АЛК в результате реакции трансаминирования. У С. У Фоб лучения на накапливающий протопорфирин мутант были выделены мутанты г и , . Ошт обладали сниженным содержанием хлорофилла и АЛКсинтетазной активностью. ЯМА роду.