Молекулярно-генетический анализ полиморфизма ДНК у потомков мышей, подвергшихся острому и хроническому γ-облучению

• Автор: Мязин, Андрей Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы

1.1. Геномная нестабильность как эффект облучения

1.2. Полиморфизм понятие, причины, значение

1.2.1. Маркеры полиморфизма ДНК

1.2.1.1. Мини и микросателлиты .

1.2.1.2.АРО и АРЬРмаркеры.

1.2.2. Некоторые методы изучения маркеров полиморфизма ДНК.

1.2.2.1. Рестрикционные ферменты

1.2.2.2. Полимеразная цепная реакция.
1.2.4. Увеличение степени вариабельности ДНК как генетический эффект
облучения.
1.3. Половые клетки мишень для действия ионизирующего излучения
1.3.1. Некоторые методы изучения генетических эффектов радиации в половых
клетках.
1.3.1.1 Доминантные летальные мутации
1.3.1.2. Реципрокные транслокации
1.3.1.3 Аномальные головки спермиев
1.3.2. Стадии сперматогенеза.
1.3.3. Различие стадий сперматогенеза по чувствительности к радиационному
воздействию
1.3.4. Летальное действие радиации.
1.3.5. Различия чувствительности половых клеток к генетическому действию
II. Материалы и методы.
.1. Однократное облучение животных.
.2. Хроническое облучение животных.
.3. Реактивы и оборудование.
.4. Выделение ДНК.
.5. Постановка полимеразной цепной реакции
.6. Электрофоретический анализ в агарозном геле.
.7. Документирование результатов электрофореза
.8. Анализ паттернов амплифицированной со случайными праймерами ДНК профилей.
.9. Выделение и обработка пероксидом водорода лимфоцитов
селезенки.
Метод электрофореза единичных клеток.
Статистическая обработка результатов. .
III. Результаты и обсуждение.
III. 1. Плодовитость, соотношение полов в потомстве однократно и
хронически облученных мышей.
III.2. Вариабельность продуктов амплификации со случайными праймерами у потомков облученных мышей.
1.2.1. Спонтанная вариабельность продуктов потомства контрольных групп мышей двух различных линий
1.2.2. Повышение частоты новых полос у потомков мышейсамцов линии В, однократно облученных в дозах Гр
1.2.2.1. Повышение частоты новых полос у потомков мышейсамцов линии , однократно облученных в дозе 1 Гр
1.2.2.2. Повышение частоты новых полос у потомков мышейсамцов линии , однократно облученных в дозе 2 Гр.
1.2.2.3. Повышение частоты новых полос у потомков мышейсамцов линии , однократно облученных в дозе 3 Гр.
1.2.3. Зависимость эффекта от дозы для различных стадий сперматогенеза при
облучении в диапазоне доз 1 3 Гр.
III.2.3.1. Средний уровень полиморфизма при облучении 1 3 Гр.
III.2.3.2. Статистический анализ результатов изучения вариабельности
маркеров по частотам появления новых полос.
III.2.4. Частота исчезновения родительских полос в паттернах потомков
1.3. Выход мутаций в расчете на 0, Гр при остром облучении на стадиях сперматид и сперматогониев.
1.4. Влияние низкоинтенсивного хронического облучения на уровень полиморфизма ДНК потомков мышей линии СВА
1.5. Определение частоты реципрокных транслокаций в сперматоцитах мышей
1.6. Чувствительность спленоцитов мышей линий и к пероксиду водорода после облучения в различных
III.6.1 Изменение количества спленоцитов мышей линии в отдаленные
сроки после облучения в дозах Гр.
II 1.6.2. Зависимость среднего индекса комет спленоцитов мышей линии от концентрации пероксида водорода
1.6.3. Чувствительность спленоцитов мышей линии к пероксиду
водорода после облучения в дозах Гр
1.6.4. Динамика изменения чувствительности спленоцитов мышей линии к пероксиду водорода при хроническом
облучении.
1.7. Обсуждение
IV. Выводы.
V. Список литературы.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЛПЭ линейная передача энергии ОБЭ относительная биологическая эффективность Р1И ионизирующие излучения РТ реципрокные транслокации АГС аномальные головки спермиев ДЛМ доминантные летальные мутации ДБС ДНКбелковые сшивки МНС минисателлиты МКС микросателлиты НСГ нестабильность генома ПЦР полимеразная цепная реакция ЕРФ естественный радиационный фон ФСБ фосфатносолевой буфер i i i i i i iii i ii i i i i x
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В последние годы постоянно увеличивается количество работ, посвященных оценке изменения вариабельности маркеров полиморфизма ДНК у потомства облученных родителей. Маркеры полиморфизма ДНК, такие как микро МКС и минисателлитные локусы МНС, ДНК хромосомы, митохондриальная ДНК имеют ряд характеристик, которые делают их более удобными для изучения радиационногенетических эффектов Алтухов, Салменкова, Курбатова и др. Наибольший интерес исследователей в области изучения генетических эффектов радиации привлекают мини и микросателлитные локусы. Помимо радиационного фактора, была показана индукция мутационного процесса в МКС и МНС при воздействии химических мутагенов, а так же вследствие оксидативного стресса, вызываемого действием перекиси водорода , i, , , . Появление относительно простых и быстрых методов работы с ДНК позволило выявить в начале х годов взаимосвязь повышенной вариабельности микросателлитных локусов и онкологических заболеваний. Следствием изучения корреляции онкологических заболеваний и индуцированной изменчивости микросателлитных локусов стало введение в научную практику нового термина микросателлитная нестабильность i, . Безлепкин, Газиев, . Использование МКС и МНС для изучения генетических последствий облучения дает целый ряд преимуществ перед традиционными методами. Большая часть исследований в этой области посвящена изучению генетических последствий малых доз облучения, то есть до 0,2 Гр , . Целый ряд работ v и соавторов показывает передающееся по наследству увеличение вариабельности минисателлитных локусов в результате воздействия ионизирующих излучений в различных дозах, как на модельные объекты, так и на человека v . Диапазон доз от 0,5 до 1 Гр и выше охвачен молекулярногенетическими исследованиями в значительно меньшей степени. Вопрос о закономерностях радиационной индукции полиморфизма ДНК при воздействиях средних и больших доз ИИ и связи такой индукции с нестабильностью генома остается открытым. V, показали, что при воздействии у радиации в дозах 1 3 Гр наблюдается достоверное увеличение частоты мутаций с увеличением дозы облучения , ivi, i . Помимо анализа вариабельности сателлитных локусов, довольно широкое распространение получил метод оценки генетической вариабельности с помощью полиморфной ДНК, амплифицированной с серией случайных праймеров ii i , , или i i , . Данный метод дает возможность быстрого сканирования генома за счет получения фингерпринтов отпечатков пальцев ДНК и может быть использован для оценки изменений, произошедших в нем под воздействием какихлибо факторов. Набор фрагментов ДНК, получаемых при амплификации со случайными праймерами, обладает генотипспецифичностью и может служить критерием при изучении генетических различий между близкородственными видами, линиями, сортами, породами и штаммами. Также, иногда, используется смесь из 2 4 таких праймеров, такая модификация носит название i Матвеева и др. Анализ вариабельности полиморфной ДНК применяется в радиационногенетических исследованиях, как на модельных объектах, так и для мониторинга популяций человека. Безлепкин с соавторами Безлепкин и др. Гр с помощью . Примером использования данной технологии в радиционногенетическом мониторинге может служить работа i с соавторами, которые показали увеличение частоты мутаций с помощью у детей ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС i . Существует множество других примеров удачного использования полиморфной ДНК для оценки генетической вариабельности, возникающей у потомков облученных родителей. Но значительная часть таких исследований посвящена эффектам малых доз, тогда как информации о генетической вариабельности, возникающей при воздействии доз ИИ от 0,5 Гр и выше, явно недостаточно. Изучение молекулярногенетических эффектов средних и больших доз радиации дало бы более полное представление о механизмах воздействия ионизирующего излучения на геном. Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении молекулярногенетических эффектов радиационного воздействия у мышей линий и СВА и их потомков в условиях однократного и хронического облучения в различных дозах.