Молекулярно-генетический анализ растений-регенерантов, полученных из длительно культивируемых каллусов гороха

• Автор: Кузнецова, Оксана Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 195 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы.

1.1.Использование культуры клеток и тканей растений.

1.2. Генетические изменения, возникающие в культуре клеток

и тканей растений

1.2.1. Изменение плоидности и числа хромосом.

1.2.2. Хромосомные мутации.

1.2.3. Генные мутации

1.2.4. Внехромосомные изменения

1.3. Факторы, вызывающие генетическую нестабильность культивируемых клеток

1.3.1. Гетерогенность исходного материала.
1.3.3.Условия культивирования.
1.3.4. Влияние типа экспланта растения
1.3.5. Типы морфогенеза.
1.3.6. Продолжительность культивирования
1.4. Механизмы сомаклональной изменчивости
1.5. Способы выявления сомаклональной изменчивости.
1.5.1. Фенотипический морфологический уровень
1.5.2. Цитогенетическое изучение.
1.5.3. Выявление полиморфизма на молекулярном уровне.
1.5.3.1. Белковые маркеры
1.5.3.2.Методы анализа полиморфизма ДНК
1.5.3.2.1. Молекулярные маркеры на основе ПДРФ.
1.5.3.2.2. Анализ полиморфизма генома методом полимеразной
цепной реакции.
ЯАРО анализ
маркеры
маркеры
маркеры
Комплексный анализ сомаклональной изменчивости
Глава 2. Материалы и методы.
2.1. Исходный материал
2.2.Введение клеток в культуру i vi и получение растенийрегенерантов
2.3. Анализ пыльцы у растений регенерантов
2. 4. Выделение ДНК гороха для ПЦРанализа
2.5.Метод ПЦРанализа с использованием и Iпраймеров.
2.6. Проведение электрофореза в агарозном геле
2.7. Клонирование фрагмента.
2.7.1. Выделение фрагментов из геля.
2.7.2.Лигирование фрагментов ДНК с вектором
2.7.3.Трансформация . i штамма 9 плазмидной ДНК
2.8.Выделение плазмидной ДНК из .i .
2.9.Анализ плазмидной ДНК на наличие вставки
2Секвенировани е
2 Полное секвенирование длинных фрагментов
2 Математические методы обработки данных
21. Статистические методы.
22. Качественная и количественная оценка полиморфизма.
2 Анализ нуклеотидных последовательностей.
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Получение исходного материала
3.2 Анализ физиологических, морфологических и количественных признаков у регенерантов гороха в потомстве 2.
3.3. Молекулярногенетический анализ растений . регенерантов 0 и сомаклонов гороха
3.3.1. Молекулярногенетический анализ растений регенерантов первой группы, полученных после восьми месяцев культивирования каллусов в условиях i vi
3.3.2. Молекулярногенетический анализ растений регенерантов второй группы, полученных после десяти лет культивирования каллусов в условиях i vi
3.3.3. Количественная оценка полиморфизма ДНК у регенерантов гороха с помощью молекулярных и I маркеров
3.3.4. Молекулярногенетический анализ сомаклонов гороха
3.4. Анализ наследования полиморфных фрагментов.
3.5. Сиквенс полиморфных нуклеотидных последовательностей,
выявляемых и I методами.
3.5.1. Фрагмент 0
3.5.2.05 .
3.5.3. Фрагмент V0.
3.5.4. Фрагмент С50
3.5.5. Фрагмент В8Ш0
3.5.6. Фрагмент В40
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Диплоидный набор наблюдался также у регенерантов сорта Рапорт, несмотря на то, что в каллусах, устойчивых к атразину, наблюдался высокий уровень полиплоидных клеток. Показано влияние гербицидов на возникновение изменений в системе i vi в зависимости от времени культивирования каллусов на селективной среде. Так, при увеличении продолжительности культивирования каллусов на селективной среде с 6 до месяцев происходила потеря регенерационной способности. Однако, проведенные исследования показали, что гербициды вызывали не только генетические аберрации и изменение числа хромосом, но таюже эпигенетические изменения в каллусных клетках гороха Ежова и др. У ряда каллусных линий твердой пшеницы выявлен довольно высокий процент геномных мутаций, которые выражаются в существовании полиплоидных более клеток и анеуплоидных клеток. Однако, при исследовании числа хромосом у растенийрегенерантов, полученных после первого и второго пассажа, был обнаружен только один полиплоид и один стерильный анеуплоид. Нго, реализация таких изменений у растенийрегенерантов наблюдалась с частотой 1,7 Бабаева, Петрова и др. Для некоторых видов показано, что даже несмотря на наличие разного уровня плоидности в культуре клеток, при регенерации преимущество получают диплоидные клетки. Это, вероятно, связано с тем, что при регенерации растений идет отбор нормального набора хромосом. Хромосомные мутации. В первичном каллусе, кроме изменения плоидности, происходит появление хромосомных аберраций, таких как делеции, транслокации, инверсии, связанные с разрывами хромосом. Известно, что в норме уровень спонтанных аберраций хромосом, регистрируемых в анафазах митоза у интактных растений, редко превышает 1 , однако, в первичном каллусе частота таких мутаций, как правило, выше. Так, по данным Кунаха В. А., уровень анафазных аберраций в первичном каллусе гороха превышал , табака 7, а у других растений он колебался от 2 до 4 . Кунах, . В культуре клеток может произойти нарушение нормального клеточного деления, в результате чего возникают хромосомные разрывы РЫШрз ега1. Хромосомные разрывы и их последствия делеции, дупликации, инверсии, транслокации являются причинами хромосомных нарушений, которые могут вызывать мутации непосредственно или через эффект положения, путем изменения экспрессии гена в результате его попадания в непосредственную близость к специфическому гетерохроматиновому району РэесЬке, РЫШрэ, . У одного из исследуемых генотипов гороха была показана повышенная частота хромосомных аберраций и низкая частота регенерации растений из таких каллусных клеток, у другого наоборот низкая частота хромосомных аберраций с повышенной регенерационной способностью , , . В длительно культивируемых каллусных клетках гороха и регенерировавших из них побегах было показано, что большинство кариотипических изменений элиминировались при семенном размножении регенерантов . Анализ мейоза в материнских клетках пыльцы у регенерантов не обнаружил крупных аберраций хромосом. В тоже время в нескольких линиях регенерантов были обнаружены не типичные для гороха ассоциации бивалентов на стадии метафазы I, отличающиеся от ассоциаций хромосом при реципроклшх транслокациях, а также слипание хромосом на стадиях анафазы и телофазы I Гостимский и др. Таким образом, изменение числа и структуры хромосом влияет на способность к морфогенезу, так как регенерация из клеток с цитогенетическими нарушениями затруднена или исчезает вовсе. Кроме того, изменение уровня метилирования ДНК в культуре клеток может активировать передвижение мобильных элементов. Благодаря перемещению мобильных генетических элементов из одного места генома в другое происходят процессы,аналогичные транспозициям. Передвигаясь, мобильные элементы могут вызывать изменения в генной регуляции, инактивировать структурные гены или активировать молчащие гены i, , однако, такие хромосомные аберрации могут быть нестабильными. Уровень хромосомных изменений в культуре клеток варьирует в зависимости от вида растений. Например, хромосомные изменения у ржи фиксируются чаще, чем у ячменя или жемчужного проса.