Взаимодействие чужеродного генетического материала (ДНК) с геномом высших растений

• Автор: Картель, Николай Александрович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1983
• Место защиты: Минск
• Количество страниц: 362 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ДНК РАСТЕНИЙ, МЕТОДЫ ЕЕ ВЫДЕЛЕНИЯ, МЕЧЕНИЯ

И АНАЛИЗА

1.1. Структура и организация ДНК в геноме .

1.2. Методические вопросы выделения и анализа

ДНК растений

1.3. Методические вопросы получения радиоактивных препаратов ДНК и анализа радиоактивности растений

ГЛАВА 2. ВКЛЮЧЕНИЕ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК В РЕЦИПИЕНТ

2.1. Анализ проблемы .

2.2. Поглощение растениями.экзогенной гомологичной 3НДНК.

2.3. Изучение включения экзогенной ДНК методом радиоавтографии
2.4. Поглощение гомологичной 3НДнк интактными зародышами ячменя
2.5. Изучение включения экзогенной ДНК в ядра клеток зародышей ячменя с помощью двойной метки .
ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО И ФЕНОТИПИЧЕСКОГО ВЛИЯНИЯ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК НА РАСТИТЕЛЬНЫЙ ОРГАНИЗМ
3.1. Влияние экзогенной ДНК на включение 3Нти
мидина в клетки растений
3.2. Влияние экзогенной ДНК на завязываемость и всхожесть семян, рост и развитие растений .
3.3. Влияние ДНК на каллусообразование и органогенез в культуре клеток зародышей ячменя .
3.4. Влияние экзогенной ДНК на пестролистность, устойчивость к корневым гнилям и морозоустойчивость растений ячменя
3.4.1. Пестролистность
3.4.2. Устойчивость к корневой гнили
3.4.3. Морозоустойчивость .
ГЛАВА 4. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ДНК
4.1. Краткий литературный обзор .
4.2. Влияние ДНК на образование аберраций хромосом у растений ячменя .
4.3. Влияние ДНК на частоту и спектр повреждений хромосом в клетках облученных семян
ячменя.
4.3.1. Эксперименты по действию ДНК на общую частоту аберраций хромосом в клетках облученных семян
4.3.2. Влияние ДНК на соотношение одиночных и двойных мостов в клетках облученных
семян .
4.3.2.1. Зависимость эффекта ДНК от концентрации
и нативности препарата .
4.3.2.2. Эффективность ДНК разного происхождения
4.4. Частота и спектр аберраций хромосом при обработке облученных семян геномными
фракциями ДНК
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ДНК
5.1. Состояние проблемы .
5.2. Способы введения ДНК и исходный материал, использованные в экспериментах по индуцированию наследственных изменений .
5.3. Генетические эффекты чужеродной ДНК
5.3.1. Реверсия мутантного признака вакси к
дикому типу .
5.3.2. Фенотипическая изменчивость
5.3.3. Наследственные изменения хозяйственнополезных признаков ячменя .
5.4. Анализ возможных механизмов действия
ДНК на геном растений.
5.5. О перспективах получения генетической цансфорыации у сельскохозяйственных растений
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .
ВЫВОДЫ .
ЛИТЕРАТУРА


К навеске порошка добавляли буфер следующего состава 0, ЬаС1,0,5 М цитрата Ка , 0,1 трис, 0, Ы ЭДТА рН8,5. Соотношение буфера и навески было 21. Ы, осторожно перемешивали до растворения соли и охлаждали до 24С. К лизату добавляли равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом 1, встряхивали в колбе с широким дном и оставляли стоять на ночь. После этого водную фазу отделяли от хлороформа центрифугированием при 3,54 тыс. К, верхний слой осторожно отсасывали и осаждали ДНК 22,5 объемами этанола, охлажденного до С. Через мин всплывала медуза, которую осторожно переносили в ный этанол, промывали 2 раза ным и ным этанолом, подсушивали в холодильнике и растворяли в небольшом объеме 0,1 x . К раствору ДНК добавляли предварительно прогретую РНКазу С, мин до концентрации 0 мкгмл и инкубировали при С I час, затем прибавляли прогретый при С мин раствор лроназы i до концентрации 0 мкгмл и инкубировали еще 3 часа при С. После инкубации молярность раствора доводили до 1,5 М хлористым натрием. К охлажденному раствору приливали равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом, оставляли на ночь в холодильнике, затем центрифугировали при обмин. Депротеинизацию продолжали до исчезновения интерфазы. С этанола. Всплывшую медузу дважды промывали ным, а затем ным этанолом. ДНК хранили в ном этаноле в морозильной камере холодильника. Для определения концентрации выделенной ДНК, степени очистки от полисахаридов и белков использовали спектры, полученные при слектрофотометрировании на СФ4А, или Р фирмы i . Степень очистки от белков и полисахаридов определялась по коэффициентам экстинции при 0 и 0 нм, количество белка рассчитывали в основном по методу Лоури О. Н, . Концентрацию в ДНК в растворе определяли по Спирину Спирин . Многократное определение концентрации ДНК этими способами показало, что между ниш нет достоверных различий. Поэтому в дальнейшем мы применяли лишь второй способ. Примесь РНК в препаратах ДНК определяли арциновым методом Решетников В. Н. и др. Молекулярную массу препаратов выделенной ДНК определяли методом вискозиметрии. Использовали низкоградиентный трехшариковый вискозиметр Оствальда с объемом шариков I 0,5 0,2 см3 и 3 ,5 ,5 и 8,7 сек1 соответственно. Длина капилляра равна 4,5 м, диаметр 1,4 мы. Раствор полученной ДНК доводили фосфатным буфером 0, к ЯсПО 0, наРОСрН 7 6,8 до концентрации 0, с тем, чтобы исключить взаимодействие макромолекул ДНК. Затем с целью получения однонитевой ДНК раствор прогревали при С в течение мин и помещали в ледяную баню. Ю мл раствора денатурированной ДНК вносили в вискозиметр, помещенный в термостат с температурой С и давали раствору отстояться в течение часа. Затем с помощью секундомера замеряли скорость истечения раствора по 3 шарикам. Расчет молекулярной массы ДНК вели по формуле Спитковского Спитковский Д. Цейтлин П. И., . Вискозиыетрический метод определения молекулярной массы ДНК, благодаря своей простоте и удовлетворительной точности , нашел широкое применение. Он такие вполне удовлетворяет задачам наших исследований. I, а типичная спектральная кривая показана на рис. В таблице приведены усредненные данные по опытам выделения ДНК из разных мутантных линий x , i 5, ii и др. Московский 1, Надя, Зазерский и др. Сталия вале Содержа Содержа Молеку Выход лания БНК таида И0 ние лярная ДНК из ления Дпл 1 00 РНК, Содержание РНК после обработки РНКазой не превышает 36. Сходные характеристики имеют препараты ДНК, получаемые этим методом из проростков и зародышей рки, овса и пшеницы. Разработанная нами модификация метода выделения ДНК из зерновых культур отличается простотой и доступностью. Она использовалась нами при получении ДНК из ячменя, ржи, овса и других культур для всех излагаемых в диссертации экспериментов. Наш метод выделения ДНК используется также другими исследователями, в частности, в институте экспериментальной ботаники АН БССР. Рис.