Получение протопластов дрожжеподобного гриба Aureobasidium Pullulans и изучение генетических последствий их слияния

• Автор: Мироненко, Нина Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Ленинград
• Количество страниц: 163 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ с

Введение

Глава I. Обзор литературы. Новые методы генетики несовершенных грибов

1.1. Введение .

1.2. Несовершенные грибы как объекты генетических исследований .

1.3. Биологические особенности и практическое значение несовершенного гриба ii

Вагу З

1.3.1. Жизненный цикл гриба .. З

1.3.2. Экологические ниши гриба и механизмы устойчивости к экстремальным факторам среды .

1.3.2.1. . фитопатоген

1.3.2.2. . разрушитель полимеров.

1.3.2.3. Радиоустойчивость гриба.v
1.3.2.4. Устойчивость гриба к ионам тяжелых металлов
1.3.3. . , как модель для изучения дрожкевогомицелиального диморфизма у грибов
1.3.4. . продуцент полисахаридов
1.3.5. Генетикофизиологические исследования гриба
1.4. Протопласты грибов в генетических экспериментах
1.4.1. Условия получения и регенерации протопластов грибов
1.4.2. Слияние протопластов грибов .
1.4.3. Внутривидовая гибридизация грибов методом слияния протопластов
Стр.
1.4.4. Межвидовая гибридизация грибов путем слияния протопластов .
1.4.5. Межродовые слияния протопластов грибов
1.4.6. Возможные механизмы стабилизации продуктов слияния протопластов путем генетической рекомбинации.
1.4.7. Протопласты в опытах по трансформации грибов.
1.5. Заключение
Глава П. Материалы и методы
2.1. Штаммы гриба и мутанты, использованные в работе
2.2. Условия культивирования
2.3. Выделение мутантов
2.3.1. УФмутагенез и отбор ауксотрофных мутантов
2.3.2. Химический мутагенез
А. Обработка нитрозометилмочевиной НММ
Б. Обработка гидроксиламинопурином ГАП
2.4. Получение протопластов и условия их регенерации.
2.5. Метод слияния протопластов
2.6. Генетический анализ первичных и вторичных ПСП.
2.6.1. Анализ митотической стабильности ПСП.
2.6.2. Анализ индуцированной митотической сегрегации
2.6.2.1. Индуцирование УФизлучением .
2.6.2.2. Индуцирование хлоралгидратом
2.6.2.3. Индуцирование беномилсм .
2.7. Метод окраски ядер в клетках гриба
2.8. Определение количества ДНК в клетках гриба методом проточной цитофлуориметрии
2.9. Статистическая обработка результатов .
Глава Ш. Характеристика исходных штаммов
3.1. Морфологокультуральные признаки
3.2. Устойчивость гриба к ионам Со2 и Си2 .
3.3. Устойчивость штаммов гриба к индукторам гаплоида зации .
3.4. Устойчивость клеток гриба к УФизлучению .
3.4.1. Летальное действие УФизлучения
3.4.2. Мутагенное действие УФизлучения .
Глава 1У. Протопласты . и их слияние
4.1. Получение протопластов и их регенерация.
4.2. Внутри и межштаммовые слияния протопластов
4.3. Слияние протопластов и тест на комплементацию
Глава У. Генетический анализ продуктов слияния протопластов . .
5.1. Генетический анализ первичных ПСП.
5.2. Генетический анализ вторичных ПСП.
5.2.1. Генетический анализ нестабильных ПСП .
5.2.2. Генетический анализ стабильных ПСП .
5.2.2.1. Характеристика митотической стабильности ПСП
5.2.2.2. Индуцированная УФлучами нестабильность ПСП.
5.3. Митотическая нестайальность,индуцированная хлоралгидратом
5.4. Митотическая нестабильность, индуцированная беномилом III
5.5. Сравнение количества ДНК на клетку в ПСП и родительских штаммах
Глава У1. Обсуждение
Выводы
Использованная литература .
5 ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Для грибов, не имеющих ни полового, ни парасексуапьного процесса, генетические исследования ограничивались выделением и характеристикой спонтанных и индуцированных мутантов. К таким грибам относятся как представители миделиальных несовершенных грибов, так и обширная группа организмов, относящаяся к так называемым дрожжеподобным грибам. Зто сборная группа микроорганизмов, объединяющая грибы с дрожжевым и миделиальныгл диморфизмом. Дролжеподобные грибы включают в себя представителей из разных классов грибов, таксономическое положение некоторых из них до сих пор остается спорным Бабьева, . Благодаря возможности выращивать их в дрожжевой фазе, эти грибы удобны для микробиологических работ и представляют несомненный интерес в практическом и теоретическом плане. Именно дрожлсеподобные грибы являются, повидимому, наиболее подходящими объектами для применения к ним новых методов генетического анализа. Примером успешного приложения одного из таких методов могут служить генетические исследования диморфного патогенного гриба i i . Считают, что этот организм в природе существует только в бесполом состоянии. Используя метод слияния протопластов, у него был воспроизведен парасексуальный процесс . , , , ii ,, установлено сцепление некоторых из них . Пока определены 3 группы сцепления в результате изучения митотического расщепления ПСП различных маркированных линий . Можно ожидать, что в скором будущем для генетического анализа станут доступными такие интересные для медицины признаки этого гриба, как патогенность и диморфизм. Также на основе парасексуального процесса, воспроизведенного путем слияния протопластов, построены генетические карты ii ii . i vi i . I.3. Жизненный цикл гриба . В нашей лаборатории для отработки и приложения новых генетических методов протопластирования и слияния протопластов, в качестве объекта был выбран гриб ii Вагу синонимы i. , i,i и др. ,, относящийся к сем. i темноцветные гифомицеты ЕЛИ черные дрожжи КЛ. . Он обладает рядом особенностей, делающих его удобным и практически важным объектом генетических исследований. Жизненный цикл гриба описан в работе Рамос и ГарсияАча , i ,. Ранние сведения о нахождении сумчатой стадии гриба , , оказались необоснованными. В настоящее время общепринято, что половой стадии у . Ранее предпринимались попытки получить гибриды этого гриба естественным путем, т. На твердой минимальной среде цри крестообразном посеве штрихами двух ауксотрофных мутантов в месте перекреста образовывалась зона роста. Однако гибридную природу полученных прототрофов доказать не удалось. Автор сделал вывод, что были получены псевдогетерокариотичные формы, появление которых, возможно, было обусловлено синтрофизмом и идущим в смешанных культурах мутационным процессом. Полный вегетативный цикл гриба можно подразделить на несколько субциклов рис. , i ,. Несмотря на большое разнообразие клеточных форм, можно получить чистую культуру гриба, например, в дрожжевой форме бластоппоры. Гриб размножается только вегетативным путем конидиями, которые в изобилии образуются на мицелии. Мицелий септирован, многоклеточный конидии одноклеточные, овальные, цилиндрические или прямые, образуются на концах конвдиеносцев. Клетки гриба чаще одноядерные, но встречаются и 2х, и 3х ядерные. Гриб считают гаплоидным, но факт этот остается недоказанным и спорным. На гаплоидность гриба указывает довольно высокая частота мутирования 0,4 ауксотрофных мутаций при летальности ,9 при УФоблучении Ковальцова, Левитин, . Следует отметить, что вопрос о плоидности грибов, для которых не известен мейоз, остается в большинстве случаев дискуссионным. В последнее время наиболее интенсивно в этом отношении изучают гриб с. В результате биохимических и генетических анализов доказано его естественное диплоидное состояние, хотя ранее он считался гаплоидным , , i .