Физиологическая роль немышечных миозинов в подвижности клеток

• Автор: Ненашева, Татьяна Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.13
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Екатеринбург
• Количество страниц: 157 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общий обзор

1.1.1. Миозин1

1.1.2. Мышечный миозин

1.1.3. Немышечный миозин

1.1.4. Миозин

1.1.5. Миозин

1.1.6 Миозин7

1.1.7. Миозин

1.2. Роль цитоскелета в поддержании клеточной формы и подвижности

1.2.1. Актин и актинсвязывающие белки
1.2.2. Роль микротрубочек в поддержании формы клетки
1.3. Свойства плазматической мембраны эукариотических клеток
1.4. Методы визуализации одиночных молекул, применяемые для микроскопии живых клеток
1.4.1. Введение
1.4.2. Лазерная эпифлуоресцентная микроскопия
1.4.3.Конфокальная микроскопия
1.4.4.Микроскопия близкого поля
1.4.5. 2х фотонная микроскопия
1.4.6.Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения ФМПВО
1.4.7. Детекция и трассировка флуоресцирующих молекул на поверхности клеточной мембраны
2. МЕТОДЫ
2.1. Культивирование и трансфекция клеток
2.1.1. Культивирование клеток
2.1.2. Хранение клеток
2.1.3. Трансфекция клеток фрагментами ДНК
2.2. Описание установки Флуоресцентной Микроскопии Полного Внутреннего Отражения ФМПВО
2.2.1. Камера для прижизненной микроскопии
2.2.2. Оптическая схема Флуоресцентной Микроскопии Полного Внутренннего Отражения ФМПВО
2.2.3. Описание цифровых видеокамер, применяемых для записи
2.3. Методы детекции и трассировки одиночных молекул в живых клетках
2.3.1. Метод детекции неподвижных флуоресцирующих молекул
2.3.2. Метод детекции и трассировки флуоресцирующих молекул, движущихся на клеточной мембране
2.4. Автоматическое отслеживание траекторий миграции клеток
2.5. Количественная оценка подвижности клеток на поверхности субстрата
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
3.Подвижность эндотелиальных клеток и фибробластов на поверхности субстрата
4. Динамика движения отдельных молекул миозинов 1е, 2Ь, 6, 7, на мембране фибробластов и эндотелиальных клеток
4.1. Динамика движения отдельных молекул миозинов 1е, 2Ь, 6, 7, на мембране фибробластов
4.1.1. Миозин1е на мембране фибробластов
4.1.2. Миозин2Ь в фибробластах
4.1.3. Миозин6 на мембране фибробластов
4.1.4. Миозин7 на мембране фибробластов
4.1.5. Миозин и его субфрагменты на мембране фибробластов
Полноразмерный миозин
Безголовая форма миозина
МуТН4БЕЯМ
Плекстрин гомологичный домен 1,2 ИГ
Плекстрин гомологичный домен 3 ПГЗ
Плекстрин гомологичный домен 1,2,3 ПГ
Резюме
4.2. Динамика движения отдельных молекул миозинов 1е, 2Ь, 6, 7, и на
мембране эндотелиальных клеток НЦУЕС
4.2.1. Миозин1е на мембране НЦУЕС
4.2.2. Миозин2Ь в эндотелиальных клетках НУЕС
4.2.3. Миозин6 в эндотелиальных клетках НЦУЕС
4.2.4. Миозин7 в эндотелиальных клетках НЦУЕС
4.2.5. Полноразмерный миозин в эндотелиальных клетках НЦУЕС
Плекстрин гомологичный домен 1,2 ПГ
Плекстрин гомологичный домен 3 ПГЗ
Плекстрин гомологичный домен 1,2,3 Г
Резюме
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Латеральная подвижность немышечных миозинов, прикрепляющихся к плазматической мембране, зависит не только от класса миозина, но и от свойств плазматической мембраны тина клеток а также, в некоторых случаях, от температуры. Каждый из миозинов 1е, 6, 7а, имеет свое специфическое место локализации и функционирования в клетке. Апробация работы и публикации. Результаты работы были апробированы на конференции о. Эльба, Италия сентября г. Пущино мая г на ежегодной конференции биофизического общества в Балтиморе США ii i i, i 6 марта г. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе в журналах, рекомендованных ВАК 1 работа. Внедрение результатов исследования Результаты диссертационной работы могут быть использованы для исследования различных процессов в иммунологии и патологической физиологии. В настоящее время результаты диссертации используются в отделе физической биохимии национального института медицинских исследований Лондон, Великобритания для анализа подвижности изолированных клеток, мигрирующих на поверхности субстрат, и для оценки подвижности одиночных флуоресцирующих молекул, присоединенных к базальной мембране исследуемых клеток. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической и двух экспериментальных глав, обсуждения результатов, заключения и списка литературы из 1 наименования. Диссертация изложена на 5 страницах, включая рисунков. Автор приносит благодарности Дж. Моллою и Г. Машанову Национоальный институт медицинских исследований, Великобритания, в лаборатории которых были выполнены все эксперименты М. Пекам Лидский университет, Великобритания за предоставление ДНК ПГ, ПГ3, ПГЗ, миозина, миозина6 и миозина7а Р. Чейни Университет Северной Каролины, США за предоставление ДНК миозина, безголового миозина и 4 домена Б. Г. Юшкову за руководство этой работой и полезные замечания. Эта работа была поддержана грантом физиологического общества Великобритания. В настоящее время открыто классов миозинов, существенно отличающихся своей структурой и функциями в клетке и этот список продолжает пополняться. По принятой в начале х годов классификации классы миозинов обозначались римскими цифрами, однако с ростом их числа использование арабских цифр стало более удобным, поэтому в этой работе классы миозинов обозначены арабскими цифрами например, миозина. Миозины встречаются у большинства видов многоклеточных и одноклеточных организмов растений и животных, в разных тканях , 1 Рисунок 1. Основным признаком миозинов является наличие моторного домена или головки, способной присоединяться к актиновым филаментам и преобразовывать химическую энергию гидролиза АТФ в механическую энергию. Моторный домен соединен с шейным доменом, который значительно различается у разных классов миозинов, Считается, что шейный отдел выполняет регуляторные функции, а также служит рычагом, необходимым для увеличения размера шага молекулы во время совершения механохимического цикла взаимодействия с актином. К шейной части может присоединяться от одного до шести специфических белков типа кальмодулина легкие цепи, которые регулируют активность многих, но не всех миозинов. Присоединение легких цепей также влияет на механические свойства молекулы миозина. Часть миозинов, такие как миозины 2, 5 и 6, являются димерами. Такие миозины имеют участок, содержащий последовательность аминокислот аспирали, необходимой для соединения мономеров в димер. Все классы миозинов также имеют хвостовой домен разной длины и сложности, необходимый для выполнения специфических клеточных функций. Ю 4. Рисунок 1. Филогенетическое древо миозинов . Мутации немышечных миозинов приводят к нарушению клеточной подвижности. Кроме этого могут быть нарушены функции специфических клеток, например, чувствительного эпителия во внутреннем ухе. За трансформацию механического сигнала в волосках слуховых рецепторов отвечает несколько различных миозинов, например, миозин 1р, 6 и 7. При дефектах этих белков происходит нарушение строения и функции рецепторов. Миозин3, найденный у дрозофилы, имеет последовательность аминокислот для присоединения протеинкиназы к моторному домену этого миозина.