Вовлечение кальпаиновой системы в аутоиммунные нейродегенеративные процессы (на модели аллергического энцефаломиелита крыс)

• Автор: Карпенко, Марина Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.13
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 177 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Аутоиммунный нейродегенеративный процесс и его моделирование на животных .

1.1.1. Патогенетические механизмы аутоиммунного нейродегенеративного процесса на примере и ЭАЭ
1.1.2. Разработка новых подходов к лечению аутоиммунной нейродегенеративной патологии.

1.2. Кальпаиновая система внутриклеточных протеаз

1.2.1. Структура капьпаинов

1.2.2.Тканевая локализация калышинов.

1.2.3.Регуляция активности кальпаинов

1.2.4. Физиологические функции капьпаиновой системы
1.2.5. Участие кальпаиновой системы в патологических процессах.
1.3. БЕЛОК i i.
1.3.1 .Структурные и биохимические свойства белка .
1.3.2.Физиологическая роль белка
1.3.3.Участие белка АР в патологических процессах
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Животные
2.2. Индукция ЭАЭ
2.3. Оценка клинического течения заболевания.
2.4. Препарат
2.5. Забор материала.
2.6. Выделение тотальной мРНК
2.7. Обратная транскрипция полимеразная цепная реакция ОТПЦР
2.8. Электрофорез РНК и ДНК в агарозном геле.
2.9. Экстракция белка .
2 Измерение концентрации белка.
2 Одномерный электрофорез белков в полиакриламидном геле в системе уксусная кислотамочевина
2 Окраска белков в ПААГ
2 Препаративный электрофорез белков.
2 Иммуноблоттинг белков.
2 Иммуноферментный анализ.
2 Определение активности кальпаинов.
2 Методы математической статистики
2 Используемые реактивы.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Характеристика развития ЭАЭ
3.2. Экспрессия мРНК и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦС в индуктивную фазу ЭАЭ.
3.3. Экспрессия мРНК и активность кальпаинов в иммуноцитах и клетках ЦНС животных с различной тяжестью течения ЭАЭ
3.4. Влияние иитраназального введения низких доз ингибитора кальпаина I на выраженность ЭАЭ
3.5. Экспрессия мРНК САР, распределение белка ОАР и его фрагмента ОАР
в клетках ЦНС в процессе развития ЭАЭ при различной тяжести течения болезни
3.6. Белок САР в СМЖ крыс с различной тяжестью течения ЭАЭ
Заключение
4. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИ ТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
гкг главный комплекс гистосовместимости
ГСС ганглиозные клетки сетчатки
ГТФ гуанозин5трифосфат
ГЭБ гематоэицефалический барьер
Д.п.и. день после иммунизации
ИЛ интерлейкин
ИФН ру интерферон ру
ки клинический индекс
мРНК матричная РНК
ОБМ основной белок миелина
ОУПЦР обратная транскрипция полимеразная цепная реакция
ПААГ полиакриламидный гель
ПАФ полный адъювант Фрейнда
ПК АМС протеинкиназа АМС
рассеянный склероз
смж спинномозговая жидкость
ТРК Тклеточный рецептор
ФНОа фактор некроза опухолейа
ФРИ фактор роста нервов
ФРФ фактор роста фибробластов
ЦНС центральная нервная система
ЭАЭ экспериментальный аллергический энцефаломиелит
АЭАЭ ЭАЭ, вызванное адоптивным переносом Тлимфоцитов
пэлэ прицельное ЭАЭ
эгс энцефалитогенная смесь
ЭДТА этилендиаминтстрауксуеная кислота
АВР0 iii i 0
АМРА i3xixi
АРР i i
СаМК кальмодулиновая киназа
X iix2,3i
iv ii i
x i i
i i
3 фрагмент 6 белка
I ii i
I3 инозитолтрифосфат
II казеиновая киназа
1 ал ьфаЬбета2и нтерин
ii
2 ii i
2 3 матриксная металлопротеаза2
X 2,3ix6i7ixi
i i i i
i i i
метилЗасгартат
оксид азота
синтаза
1 i i i
i i i
i i
i
V4 альфа4бета1 интегрин
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Таким образом, существует несколько видов ЭАЭ, отличающихся способом индукции заболевания, который выбирается исследователями в зависимости от цели эксперимента. Многочисленные исследования показали, что основные механизмы поражения ЦНС в экспериментальных моделях аутоиммунного энцефаломиелита, сходны с таковыми у пациентов с рассеянным склерозом i . У животных с идуцированным ЭАЭ, как и у людей при , наблюдается аутоиммунный ответ на компоненты миелина, приводящий к демиелинизации, а затем и к дегенерации аксонов и, в итоге, к гибели нервных клеток проявляется патологическая цепь событий с развитием парезов, параличей и другими симптомами болезни. В настоящее время в патогенезе и ЭАЭ выделяют четыре ключевых этапа . Сенсибилизация Тлимфоцитов на периферии под действием мозгового антигена и увеличение проницаемости ГЭБ. Миграция активированных Гклеток в ЦНС и активация антиген представляющих клеток непосредственно в мозге. Эти две стадии соответствуют индуктивному латентному периоду, при котором не наблюдается клинических проявлений. Развитие аутоиммунных и воспалительных реакций в мозге, приводящих к демиелинизации нервных волокон клинический период. Массовая гибель нервных и глиальных клеток. Для некоторых видов животных с ЭАЭ, но не для людей с , характерен еще один этап супрессия патологических процессов и регенерация поврежденных тканей с последующим выздоровлением. Ниже на молекулярнобиологическом уровне будут обсуждаться механизмы, лежащие в основе каждого этапа. Первым этапом развития ЭАЭ является сессибилизация Тклеток на периферии и продукция мозгоспецифических аутоантигел активированными Влимфоцитами. При индукции ЭАЭ эти процессы инициируются в ответ на введение энцефалитогенной смеси гомогенат спинного мозга, миелин, очищенные белки миелина или отдельные пептиды этих белков с ПАФ. Причиной первичной активации аутореактивных Тклеток при могут быть несколько специфических механизмов молекулярная мимикрия эпитопы различных аутоантигенов гомологичны вирусным и бактериальным антигенам, двойственная экспрессия Тклеточного рецептора ТРК, присутствие суперантигенов Завалишин и Захарова, . На преобладающую роль клеточного звена иммунитета в инициации аутоиммунного процесса указывает способность именно сенсибилизированных Тклеток, а не антител, вызывать заболевание при переносе от больных животных здоровым реципиентам , , и др Антитела к белкам миелина не участвуют в запуске патологических процессов, но вовлечены в процесс демиелинизации i . Ii . II класса главного комплекса гистосовместимости ГКГ, а Тлимфоциты с фенотипом 8 оказывают исключительно ршуляторное действие i . Однако в последнее время несколькими независимыми исследовательскими группами были идентифицированы 8 Тлимфоциты, аутореактивные к белкам миелина , vv, для обзора i, , и продемонстрирована способность активированных 8 Тлимфоцитов индуцировать воспалительные процессы в ЦНС в отсутствии 4 Тлимфоцитов . Следовательно, как 4, так и 8 Тлимфоциты вовлечены в процесс инициации заболевания. Первые клинические проявления ЭАЭ отмечаются только через несколько дней после индукции заболевания, в частности, при АПЭАЭ через дня после адоптивного переноса активированных Тклеток. Это время необходимо для миграции Тклеток с периферии в ЦНС . ЦНС проникает небольшое количество 4 Тклеток. Эти клетки продуцируют провосгтлительные цитокины, независимо от того, узнали они антиген или нет, создавая тем самым пермиссивную среду для последующей массивной атаки. В это время большая часть Тлимфоцитов мигрирует во вторичные иммунные органы. В частности, через часов после адоптивного переноса они выявляются в лимфатических узлах тимуса, а через часа в селезенке и крови . На втором этапе накопленные во вторичных иммунных органах энцефалитогенные Тлимфоциты проникают в ЦНС, высвобождают провоспалительные цитокины и другие токсические молекулы . Клетки, которые не были активированы мозговыми антигенами, практически не проникают в ЦНС, а перераспределяются во вторичных лимфоидных органах .