Регуляция экспрессии белков-предшественников нейропептидов пищевого и оборонительного поведения виноградной улитки

• Автор: Богуславский, Дмитрий Викторович
• Шифр специальности: 03.00.13, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

1. Вводная часть

2. Биосинтез и процессинг нейропептидов

3. Нейропептиды беспозвоночных

4. Кальцийсвязывающие белки с доменом

5. Белкипредшественники в командных нейронах виноградной улитки

6. Интерференция РНК. Морфолино олигонуклеотиды.

В Материалы и методы

1. Микроэлектродная регистрация внутриклеточной активности

2. Получение и очистка поликлональных антител

2.1. Иммунизация

2.2. Получение и очистка антисыворотки

2.3. Иммуноаффинная хроматография
2.4. Двойная иммунопрсцилитация в геле метод Оухтерлони
2.5. Преципитация по Гейдельбергу
2.6. Твердофазный иммуноферментный анализ
3. Методы иммунохимии и работы с белком
3.1. Равновесный микродиализ
3.2. Метод vi
3.3. Метод i ii
3.4. Иммуноблоттинг растворов белков и пептидов
3.5. Окрашивание антителами препаратов
4. Электронная микроскопия
5. Методы работы с нуклеиновыми кислотами
5.1. Полимеразная цепная реакция
5.2. Рестрикция
5.3. Очистка ДНК через легкоплавкую агарозу
5.4. Лигирование
5.5. Приготовление компетентных клеток
5.6. Трансформация
5.7. Выделение плазмид
5.8. с колоний
5.9. Приготовление зонда к мРНК
5 Гибридизация i i на препаратах
Г Цель и задачи работы
Д Результаты
1. Исследование паттерна транскрипции гена ixi
1.1. Картирование транскрипции
1.2. Паттерн транскрипции при пищевой депривации
1.3. Изменение паттерна транскрипции в онтогенезе
2. Транскрипция 1
3. Ультраструктура командных нейронов
4. 2
4.1. Кальцийсвязы вающие свойства 2 7
4.2. Получение и проверка специфичности антител
4.3. Процессинг
4.4. Гомология 2 с другими белками
5. Селективная блокада генной экспрессии в одиночных
идентифицированных нейронах виноградной улитки
Е Обсуждение
Ж Выводы
3 Список литературы
И Публикации по теме диссертации
К Благодарности
Список сокращений
БСА бычий сывороточный альбумин
ГЭПР гранулярный эндоплазматический ретикулум
ДСНПААГ додецилсульфат натрия полиакриламидный
ИПТГ изопропилтиогалакгопиранозид
Кб 1.0 пар оснований
кД килодальтон
кДНК ДНК, комплиментарная мРНК
мРНК матричная информационная РНК
Трис трисаминометан
ПАА полиакриламид
ГИДР полимеразная цепная реакция
ЦНС центральная нервная система
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
ЭГТА этилснгликольбисаминоэтилтетраацетат
ЭПВ электронплотные везикулы
ЭПР эндоплазматический ретикулум
ВСР бромохлороиндолилфосфат
ССК холецистокинин
i
Сконец карбоксиконец
ix ii
i i
конец аминоконец
i
педальный пептид
Ргерго i
малые кардиоактивные пептиды
Введение


Отсутствие компенсаторных механизмов, часто проявляющихся при нокауте, даст возможность прямого изучения роли отдельных генов в нервной системе. Исходя из того, что молекулярные механизмы работы нервной системы едины у всех животных, данная работа может быть полезной в будущих исследованиях биосинтеза нейропептидов, как у беспозвоночных, так и у позвоночных животных. Количество нейронов, транскрибирующих предполагаемый белокпредшественник пептидов пищевого поведения ргсНех8Рапн1, увеличивается при пищевой депривации взрослой улитки, а также у ювенильной улитки к началу активного питания. Физиологические воздействия, вызывающие оборонительное поведение, увеличивают экспрессию генов 1 и 2, как в отдельных нейронах, так и во всей ЦНС, изменяя паттерн экспрессии. Ген 2 кодирует белокпредшественник с высокой кальцийсвязывающей активностью. Изменение внутриклеточной концентрации кальция в командных нейронах прямо влияет на интенсивность процессинга 2. Командные нейроны париетального ганглия имеют ультраструктуру, свойственную нейросекреторным клеткам с высоким уровнем синтеза нейропептидов и нейрогормонов сильное развитие гранулярного эндоплазматического ретикулума и комплекса Гольджи в цитоплазме этих клеток при повышении концентрации кальция наблюдается транспорт из сомы нейрона в аксонную терминаль накопленных ранее электронноплотных везикул с продуктом экспрессии гена 2. Иммунопозитивные к антителам против пептидов клетки существуют у отдельных представителей кольчатых червей, насекомых и моллюсков. Внутриклеточная инъекция специфических морфолино олигонуклеотидов избирательно блокирует экспрессию гена 2 в гигантских командных нейронах виноградной улитки. Нервная система виноградной улитки ix удобный объект для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе пластичности нервной системы. Простота строения нервной системы улитки, ее исследованность, большое количество морфологически и функционально идентифицированных и картированных нейронов , , , , а также разнообразие форм поведения, вместе с возможностью экспериментального использования большинства методов современной нейробиологии и биохимии делает улитку наиболее подходящим видом, дя изучения молекулярных основ поведения. В нашей лаборатории были найдены гены, специфически экспрессирующиеся в ограниченном количестве клеток нервной системы v . Последующая физиологическая идентификация таких нейронов обнаружила удивительно высокую корреляцию между паттернами экспрессии этих генов и распределением нейронов, входящих в рефлекторные дуги отдельных поведенческих актов. Были обнаружены гены локально экспрессирующиеся в нейронах, обеспечивающих пищевое, половое, оборонительное и исследовательское поведение виноградной улитки. Два из этих генов, 1 и 2 ix ii, были найдены преимущественно экспрессирующимися в четырех 2 или в двух 1 легко идентифицируемых гигантских премоторных интернейронах, локализованных в париетальном ганглии. Эти нейроны ключевой элемент в сети, управляющей оборонительным поведением ix i они вовлечены в габитуацию, сенситизацию, и аверсивное обуславливание , , Р. М. . В отдельных нейронах сети пищевого поведения в буккальных и в церебральных ганглиях, а также в группе неидентифицированных серотонинергических нейронах, специфически экспрессируется ген, названный ixi. Он кодирует белокпредшественник нескольких пептидов, относящихся к семейству педальных пептидов. Также в нашей лаборатории был изучен ген i, кодирующий физиологически активный пептид I и экспрессирующийся в отдельных нейронах мезоцеребрума, вовлеченных в организацию полового поведения v . В данное время мы изучаем несколько ранее неизвестных генов, повидимому, вовлеченных в организацию исследовательского поведения. Наиболее подробно нами изучен ген и кодируемый им белок 2. Он обладает несколькими особенностями, делающими его удобным объектом изучения транскрипции, трансляции и постгрансляционного процессинга в нервных клетках. Вопервых, данный ген экспрессируется в четырех гигантских командных интернейронах париетального ганглия, имеющих диаметр около 0 мкм.