Роль механосенсорного канала MscL в восприятии стрессовых сигналов клетками Synechocystis

• Автор: Люкевич, Александр Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с. : ил

Содержание
Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Структура и локализация механосенсорных каналов

1.1.1. Идентификация и выделение

1.1.2. Данные кристаллографии о структуре .

1.2. Механизм работы механосенсорного канала.

1.2.1. Модель работы канала.

1.2.2. Функционирование канала как дополнительного клапана для сброса тургорного давления в стрессовых условиях

1.3. Механосенсорные каналы других организмов.

1.4. Анализ экспрессии генов с помощью ДНКмикроэррей i.

1.4.1. Введение.
1.4.2. Применение микрочипов в изучении микроорганизмов
1.4.3. Метод ДНКмикроэррей.
1.4.4. Математический анализ данных.
1.4.5. Проблемы, возникающие при использовании микрочипов цианочипов
Глава 2. Объекты и методы исследований.
2.1. Штаммы цианобактерий
2.2. Условия культивирования.
2.3. Определение интенсивности роста культур.
2.4. Экспериментальные условия культивирования.
2.5. Анализ экспрессии генов с помощью ДНКмикроэррей.
2.6. Анализ экспрессии генов с помощью Нозернблоттинга.
2.7. Пробы для Нозернгибридизации
2.8. Определение состава жирных кислот
Глава 3. Результаты и их обсуждение.
3.1. Механосенсорный канал Мэс1 ЗупесИосуэбв.
3.2. Получение мутанта Атэс1I.
3.3. Морфологическая характеристика мутанта Атвс1I
3.4. Ростовые характеристики культур
3.5. Изменение состава жирных кислот при адаптации к пониженным температурам.
3.6. Анализ экспрессии генов и Атвс1. в условиях стресса с помощью ДНКмикроэррей
3.6.1. Контрольные эксперименты
3.6.2. Сравнение экспрессии генов у мутантного штамма и дикого типа при оптимальных контрольных условиях роста.
3.6.3. Холодовой стресс
3.6.4. Тепловой стресс.
3.6.5. Гиперосмотический стресс 0,5М и 1М сорбитом.
3.6.6. Солевой стресс 0,5М ИаС1
Заключение
Литература


Сравнение экспрессии генов у мутантного штамма и дикого типа при оптимальных контрольных условиях роста. Тепловой стресс. Гиперосмотический стресс 0,5М и 1М сорбитом. Введение. Фотосинтезирующие организмы постоянно подвергаются воздействию различных факторов окружающей среды, в связи с чем они вынуждены довольно быстро реагировать на их изменение. Механизмы восприятия и передачи стрессовых сигналов интенсивно изучаются. В настоящее время установлено, что восприятие сигналов об изменении температуры у цианобактерий связано с мембранами клетки Ьов МигаШ . Изменение физических свойств мембраны приводит к запуску каскада ответных реакций, направленных на поддержание ее оптимального состояния и, следовательно, на сохранение сопряженных с ней жизненно важных реакций, дких как фотосинтез и дыхание Мигаа V , Ьоб е а Пресноводная цианобактерия ЗупесНосуйз является очень удобным объектом для подобных исследований, так как сочетает в себе свойства бактериальной и растительной клетки. Простота культивирования, генетической трансформации, а так же наличие информации о полной нуклеотидной последовательности генома, дало возможность идентифицировать сенсорные гистидиновые киназы, отвечающие за восприятие низких температур Яигик е а. Также удалось выявить гены, индукция которых активируется в ответ на несколько различных но своей природе стрессовых воздействий. Однако природа самого универсального сенсора остается неизвестной. v . v , v . В году было показано также, что механосенсорные каналы эпидермальных растительных клеток могут изменять ряд своих параметров при снижении температуры i i . Исследование роли механосенсорных каналов в восприятии стрессовых сигналов может оказаться, таким образом, перспскгивным направлением. Целью настоящего исследования являлось изучение механосенсорного каната пресноводной цианобактерии i . РСС как возможного сенсора, чувствительного к ряду стрессовых воздействий, ведущих к значительным изменениям физических свойет мембран высоко и низкотемпературные стрессы, гиперосмогическии и солевой стрессы. Получить мутанта xi с инактивированным механосенсорным канатом. Исследовать влияние мутации по гену на ростовые характеристики клеток i в различных стрессовых условиях. Выяснить влияние мутации на накопление ненасыщенных жирных кислог в ответ на понижение температу ры. Исследовать влияние мутации на активацию или репрессию генов в различных стрессовых условиях. Глава 1. Обзор литературы. Структура и локализация механосенсорных каналов. Идентификация и выделение . Механосенсорные каналы механосенсоры широко распространены во многих про и эукариотических клетках. Механосенсорный канал с очень низкой проводимостью 0,3 нС i . vi . в цитоплазматической мембране . v . Белок состоит из 6 аминокислот и имеет молекулярную массу кДа. v . . i. Результаты проведенной очистки этого комплекса дали основание предполагать, что в нативной мембране канал организован как гомогексамер v . v . Но более поздние исследования кристаллической структуры канала методами кристаллографии и химической сшивки субъединиц показали, что активный канал является пентамером. v . . Примерно на белковый комплекс является воднодоступным. Возможность быстрого формирования гидрофобной воднонедоступной поры при закрытом состоянии зависит от состояния липидного бислоя i . v . Показано, что относительно стабилен в детергентах и может быть очищен и изучен i vi с помощью функционального восстановления в фосфолипидные липосомы. Данные кристаллографии о структуре . Структура функционального белка была установлена для патогенной бактерии i i с помощью кристаллографии и рештеносгруктурнорго анализа . Кристаллы выращивались в растворе при 3.