Анионные пероксидазы как компонент устойчивости растений пшеницы к фитопатогенным грибам

• Автор: Бурханова, Гузель Фанилевна
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. МНОГООБРАЗИЕ ПЕРОКСИДАЗ И ИХ РОЛЬ В ЖИЗНИ

РАСТЕНИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные свойства пероксидаз растений IО

1.1.1. Структура фермента пероксидазы

1.1.2. Физикохимические свойства пероксидаз

1.1.3. Молекулярное разнообразие фермента пероксидазы

1.1.4. Молекулярное разнообразие генов пероксидазы

1.2. Физиологические функции пероксидаз в растении

1.2.1. Роль пероксидаз в лигнификации клеточных стенок

1.2.2. Участие пероксидаз в ответных реакциях растения на стресс 1.3. Регуляция активности пероксидазы и ее участие в трансдукции элиситорного сигнала
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Объекты исследований
2.2. Условия проведения опытов
2.3. Фитопатогены и методы работы с ними
ф 2.3.1. Визуальная оценка пораженности растений фитопатогенами
2.3.2. Инфицирование растений
2.4. Методы биохимических исследований
2.4.1. Фиксация растительного материала для биохимических исследований
2.4.2. Получение ферментных экстрактов свободной и связанной с клеточными стенками пероксидазы
2.4.3. Определение активности пероксидаз
2.4.4. Определение активности оксалатоксидазы
2.4.5. Колориметрический метод определения белка по Бредфорду
2.4.6. Изоэлектрофокуссирование пероксидаз
2.5. Молекулярнобиологические исследования
2.5.1. Выделение и очистка ДНК из растений
2.5.2.Выделение и очистка РНК из растений
2.5.3. Измерение концентрации ДНК и РНК
2.5.4. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в ПЦР
2.5.5.Полимеразная цепная реакция ДНК
2.5.6. Реакция обратной транскрипции РНК и полуколичественный анализ экспрессии генов
2.5.7. Электрофорез фрагментов ДНК и РНК в агарозных и полиакриламидных гелях.
2.5.9. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2.6. Статистическая обработка результатов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Устойчивость образцов i к i , в связи с активностью пероксидаз различной локализации в клетке. .
3.1.1. Анализ образцов i , на устойчивость к i .
3.1.2. Связь устойчивости образцов i , к i , с активностью пероксидазы различной локализации
3.2. Выявление в структуре фермента пероксидазы пшеницы сайтов, ответственных за сорбцию к полисахаридам.
3.3. Участие оксидоредуктаз в ответных реакциях пшеницы на грибную инфекцию
3.3.1. Пероксидазы в защитных реакциях растений пшеницы, различающихся по устойчивости к возбудителю септориоза
.
3.3.2. Защитная роль оксалатоксидазы при поражении пшеницы возбудителем корневой гнили ii ii
3.2.3. Влияние инфицирования фитопатогенным грибом
В. ii на активность пероксидаз различной локализации в растениях устойчивой и восприимчивой пшеницы
3.4. Регуляция индукторами устойчивости уровня экспрессии анионной пероксидазы в растениях пшеницы при грибном патогенезе
3.4.1. Участие хитоолигосахаридов в защитных реакциях растений пшеницы при инфицировании возбудителем корневой гнили
В. ii
3.4.2. Влияние салициловой кислоты на уровень экспрессии гена анионной пероксидазы пшеницы при инфицировании каллусов
.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Являясь конституционно необходимым, этот фермент участвует в различных биохимических реакциях, происходящих в живом организме Савич, i . Поскольку пероксидаза представлена семейством полифункциональных белков, возникает определенная трудность в разграничении роли отдельных изоформ в различных физиологических процессах растительного организма и, в частности, в реализации защитных свойств растения к воздействию фитопатогенов i, , , Максимов и др. Показано, что непосредственное участие в синтезе лигнина, ограничивающего поступление питательных веществ к инфекционным структурам гриба в зоне его проникновения в ткани растения, принимает анионная пероксидаза . Одним из условий функционирования пероксидазы является наличие перекиси водорода, инициирующей активность этого фермента. Известно, что в растениях часто пероксидаза работает в комплексе с различными оксидазами, например НАДФНоксидазой Тарчевский, . При этом оксалатоксидазы играют роль поставщика перекиси водорода, а пероксидазы используют ее для окисления фенольных соединений. Однако, на фоне четкого доказательства патогениндуцированной активации оксалатоксидазы ii . Особенно скудна информация, касающаяся экспрессии генов анионной пероксидазы у мягкой пшеницы, так как полноразмерная нуклеотидная последовательность данного изофермента еще не определена. Изучение молекулярных механизмов регуляции отдельных изопероксидаз внесет вклад в понимание физиологических основ устойчивости растений к фитопатогенам. Цель данной работы состояла в выявлении роли анионной пероксидазы в механизмах формирования устойчивости растений пшеницы к фитопатогенным грибам. Определить характер изменений в активности оксидоредуктаз пшеницы различной локализации в клетке при инокуляции возбудителями грибных болезней. Провести анализ полисахаридспецифичных сайтов в предсказанных аминокислотных последовательностях пероксидаз из разных растений и на основе их нуклеотидных последовательностей подобрать праймеры для оценки уровня экспрессии гена анионной пероксидазы в растениях пшеницы. Изучить уровень экспрессии гена анионной пероксидазы у разных видов пшеницы и эгилопса при инфицировании возбудителями септориоза i , и корневых гнилей ii ii . Научная новизна. Выявлена роль оксидоредуктаз различной локализации в клетке в процессах формирования устойчивости растений к фитопатогенным грибам. АеИорз итЬеНиШа к возбудителю септориоза коррелирует с активностью пероксидаз, локализованных в клеточной стенке. Наличие в гене анионной пероксидазы пшеницы мотива, гомологичного пектинспецифичному сайту пероксидаз арабидопсиса, позволяет характеризовать его как потенциально полисахаридсвязывающий. Повышенный уровень экспрессии гена анионной пероксидазы и значительное усиление этого процесса под влиянием индукторов устойчивости коррелирует с высокой ферментативной активностью пероксидаз в растениях пшеницы. Практическая значимость работы. Полученные данные вносят вклад в понимание молекулярных механизмов естественного и индуцированного фитоиммунитета. Анализ экспрессии гена анионной пероксидазы пшеницы под влиянием хитоолигосахаридов и салициловой кислоты может быть использован для скрининга эффективности новых средств защиты растений с иммуностимулирующими свойствами. Выделенные в ходе работы образцы из мировой коллекции ВИР Ае. ЪеИиШа К, К, К, К могут быть предложены в качестве доноров устойчивости к септориозу. Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всероссийском съезде общества генетиков и селекционеров Москва , на Молодежной научной конференции Актуальные проблемы биологии и экологии Сыктывкар, , на VIII Молодежной конференции ботаников С. Петербурге, , на втором съезде по защите растений Фитосанитарное оздоровление экосистем СанктПетербург, на й Путинской школеконференции молодых ученых Биология наука XXI века Пущино, . Конкурсная поддержка работы. РФФИАгидель 3 Совместные культуры клеток пшеницы с фитопатогенами как модель для скрининга средств защиты растений с иммуностимулирующими свойствами. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.