Физиологические и молекулярные ответные реакции растений рапса на воздействие солей меди и цинка

• Автор: Радионов, Никита Викторович
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 163 с. : ил.

1.1. Приспособления растений к высоким концентрациям тяжелых металлов

1.1.1. Биологическая роль меди и цинка в растениях

1.1.2. Влияние высоких концентраций тяжелых металлов на растения

1.1.3. Клеточные механизмы детоксикации тяжелых металлов I

1.1.3.1. Микориза

1.1.3.2. Клеточная стенка и экссудаты корня

1.1.3.3. Плазматическая мембрана

1.1.3.4. Белки теплового шока

1.1.3.5. Фитохелатины

1.1.3.6. Органические и аминокислоты

1.1.3.7. Металлотионеины

1.1.3.8. Вакуолярная компартмеитация
1.1.4. Характеристика семейств транспортеров металлов растений
1.1.4.1. АТФазы тяжелых металлов СРхАТФазы
1.1.4.2. транспортеры
1.1.4.3.
1.1.4.4.
1.1.4.5. I
1.1.4.6. КатионН антипортеры
1.1.4.7.
1.1.4.8. Другие предполагаемые транспортеры металлов
1.2. Транскрипционные факторы
1.2.1. Общая характеристика
1.2.1.1. Определение
1.2.1.2. Функционирование
1.2.1.3. Механизмы действия
1.2.1.4. Строение
1.2.2. МУВфакторы в растениях
1.3. Трансгенные растения
1.3.1. Методы получения трансгенных растений
1.3.1.1. Методы прямого переноса генов
1.3.1.2. Метод трансформации растений с помощью агробактерий
1.3.2. Основные направления использования трансгенных растений
ГЛАВА 2.ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объект исследований
2.2. Выращивание растений рапса в водной культуре
2.2.1. Питательный раствор. Состав и способ приготовления
2.2.2. Посев
2.2.3. Пересадка
2.3. Условия проведения опытов
2.4. Измерение всхожести семян
2.5. Измерение длины корня
2.6. Измерение оводненности листьев рапса
2.7. Измерение биомассы
2.8. Измерение площади листа
2.9. Удержание воды
2 Определение осмотического потенциала
2 Определение интенсивности перекисного окисления липидов ПОЛ
2 Определение содержания хлорофилла
2 Определение содержания свободного пролина
2 Определение содержания ионов металлов в ткани растений
2 Выделение тотальной ДНК
2 Полимеразная цепная реакция ПЦР
. Подбор праймеров для полимеразной цепной реакции
2 Электрофорез в агарозном геле
2 Выделение тотальной растительной РНК с помощью гриозола
2 Электрофорез РНК в агарозном геле
2 Обратная транскрипция
. Обработка результатов ПЦР после обратной транскрипции
2 Трансформация рапса
. Приготовление компетентных клеток агробактерий
. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК
. Выращивание бактерий на агаризованной ЬВ среде
. Агробактериальная трансформация рапса
2 Характеристика конструкций ССЖМуЬ4 и рОАМуЬ4
2 Приложение
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Влияние ТМ на прорастание семян и рост корня проростков рапса
3.2. Ингибирующее действие избыточных концентраций солей меди и
цинка на молодые растения рапса
3.2.1. Измерение площади листа
3.2.2. Влияние тяжелых металлов на рост и накопление биомассы растений рапса
3.3. Аккумуляция ТМ в листьях растений рапса
3.4. Действие ТМ на водный статус растений рапса
3.4.1. Влияние меди и цинка на оводненность листьев рапса
3.4.2. Водоудерживание
3.4.3. Влияние мед и цинка на осмотический потенциал
3.4.4. Изменение в содержании свободного пролина под действием
3.5. Влияние ТМ на перекисное окисление липидов
3.6. Влияние ТМ на содержание хлорофилла
3.7. Влияние избыточных концентраций цинка на экспрессию генов системы его детоксикации
3.8. Получение и анализ трансгенных растений рапса, несущих ген трансфактора риса ОхМуЪ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ


Все сказанное выше позволяет надеяться, что трансгенные растения внесут определенный вклад в понимание сложной переплетенной сети механизмов адаптации растений к стрессорным факторам, а, следовательно, и сыграют роль в определении потенциальных звеньев оптимизации механизмов адаптации. Данный подход, в свете совершенствования молекулярных методов в биологии, приобретает все большую актуальность. Точечное перенесение части свойств, характерных для растений гипераккумуляторов к их менее устойчивым коллегам, благодаря молекулярной биологии, позволяет создавать растения с уникальным набором характеристик. В данной области весь поток проводимых работ можно разделить на 2 большие группы. В одной из них в качестве целевых, встраиваемых в геном растениярецигшеита, используются гены, напрямую участвующие в детоксикации ионов металлов например, гены хелаторов ионов. В другой группе используют гены, продукты которых т. В представленной работе объектом агробактериальной трансформации был выбран рапс i ii . Вес тар, благодаря хорошим регенерационным свойствам и оптимизированной процедуре трансформации данного сорта. В качестве целевого был использован ген риса 4, кодирующий трансфактор . Транскрипционные факторы в целом оказывают заметное влияние на жизнедеятельность растений. Они являют собой тонкий и точный механизм управления мириадами процессов, единовременно протекающих в растении. Семейство транскрипционных факторов является самым крупным по составу среди всех известных на сегодняшний день у растений. Только у ii идентифицировано 5 генов, относящихся к этому семейству i , . Данное семейство влияет на многие процессы в клетках растений. Благодаря своей численности, тканевой специфичности экспрессии, возможности взаимодействия с другими транскрипционными факторами, дифференциальной экспрессии на разных стадиях развития растения, продукты МуЬ генов являются чрезвычайно интересными объектами для исследований. Получение и изучение трансгенных растений с оверэкспрессией МуЬ гена способно дополнить существующие данные о роли этого интересного семейства в клетках растений. Из литературы известно, что белки данного семейства участвуют в ответах растения на неблагоприятные факторы засоление, засуху, низкие темпаратуры и др. Vi . В. . I . На примере ii показано, что высокий уровень экспрессии гена 4 увеличивает устойчивость растений к низким положительным, а также отрицательным температурам Vii . В другой работе показано, что оверэкспрессия гена, использованного в нашей работе для трансформации рапса, обеспечивает не только устойчивость к низкотемпературному стрессу, но также и к засухе. Обнаружено, что у трансгенных растений уровень мРНК пролинсинтазы и пролиндегидрогсназы был соответственно выше и ниже контрольных значений. Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в том, чтобы установить степень повреждающего действия на растения рапса i . Вестар повышенных концентраций солей меди и цинка, оценить роль некоторых генов системы защиты от их избытка и получить трансгенные растения этого сорта, несущие ген трансфактора 4, способный обеспечить повышение устойчивости к этим ТМ. Получить и проанализировать трансгенные растения рапса, содержащие ген трансфактора риса 4, продукт которого способен увеличивать устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды. Научная новизна. Примененный в данной работе комплексный подход позволил не только оценить устойчивость рапса к действию повышенных концентраций ТМ по основным физиологическим показателям, но также и проанализировать на уровне экспрессии генов участие отдельных звеньев клеточных механизмов в детоксикации ионов металлов. Практическая значимость. Рапс i . Это один из главных источников сырья для производства пищевого растительного масла, жмыхов, шротов, муки и зеленой массы для кормов, а рапсовое масло важный резерв производства биотоплива. Исследование механизмов адаптации такой ценной сельскохозяйственной культуры представляет собой актуальную проблему не только фундаментальной, науки, но и прикладной физиологии растений.