Регуляция экспрессии генов нитратредуктазы в зародышах куколя

• Автор: Рагулин, Виталий Викторович
• Шифр специальности: 03.00.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 146 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Нитратредуктаза, ес структура и функции

1.2. Регуляция экспрессии генов нитратредуктазы в растениях.

1.2.1. Регуляция нитратредуктазы нитратом

1.2.2. Регуляция цитокинином.

1.2.3. Регуляция НР светом.

1.2.3.1. Участие фитохрома в регуляции НР

1.2.3.2. Влияние фотоассимилятов на активность НР

1.2.3.3. Регуляция НР на посттрансляционном уровне.
1.2.4. Регуляция НР продуктами ассимиляции нитрата.
1.3. Общие представления об адаптации растений к неблагоприятным факторам среды.
1.3.1. Действие избыточного засоления на процесс восстановления нитрата .
1.3.2. Действие С2 на процесс восстановления нитрата.
1.3.3 Действие теплового шока на активность НР.
Глава 2. Объект и методы исследования
2.1 Объект исследования.
2.2. Методика постановки экспериментов.
2.3. Определение активности НР в зародышах куколя
2.4. Выделение тотальной РНК.
2.5. Оценка относительного уровня мРНК НР методом Нозернгибридизации.
2.5.1. Денатурация РНК.
2.5.2. Электрофорез денатурированной тотальной РНК.
2.5.3. Перенос РНК с агарозного геля на мембрану.
2.5.4. Получение Рмеченого ДНКзонда
2.5.5. Подготовка нейлоновой мембраны с РНК
2.6. Оценка относительного уровня мРНК НР методом обратной
транскрипцииполимеразной цепной реакции ОТПЦР
2.6.1 Очистка тотальной РНК от примесей ДНК
2.6.2. Получение кДНК
2.6.3. Проведение полимеразной цепной реакции
2.6.4. Оценка результатов ПЦР
2.7. Создание конструкции для оверэкспрессии фрагмента гена НР в .i и очистка этого белка
2.7.1. Выделение тотальной ДНК из зародышей куколя.
2.7.2. Получение фрагмента гена 2
2.7.3. Получение плазмиды
со встроенным в нее фрагментом гена 2
2.7.4. Лигирование плазмиды с фрагментом гена 2
2.7.5. Приготовление компетентных клеток штамма .i 5.
2.7.6. Трансформация бактерий .i.
плазмидой с фрагментом гена НР куколя
2.7.7. Проверка экспрессии фрагмента гена 2 куколя и синтеза кодируемого им белка в .i
2.7.8. Очистка рекомбинантного белка НР от других белков .i
2.7.9. Перенос белка из полиакриламидного геля.
на иитроцеллюлозную мембрану.
Глава 3. Результаты н их обсуждение
3.1. Индукция активности НР нитратом и цитокинином.
3.2 Влияние цитокинина и нитрата на уровень мРНК НР
3.3. Экспрессия индивидуальных генов НР зародышей куколя в ответ на действие нитрата и цитокинина
3.3.1. Основы метода ОТПЦР, используемого для оценки
транскриптов индивидуальных генов
3.3.2 Подбор праймеров для ОТПЦР.
3.3.2.1 Подбор праймеров для индивидуальных генов НР.
3.3.2.2. Подбор праймеров для контрольного гена
3.3.3. Экспрессия индивидуальных генов НР
3.4. Влияние ИаС1 на активность НР и на уровень транскриптов кодирующих ее генов.
3.5. Влияние СсЮ на активность НР и на уровень транскриптов кодирующих ее генов.
3.6. Влияние теплового шока на активность Р и на уровень транскриптов
кодирующих ее генов
3.7 Создание конструкции для синтеза фрагмента белка НР куколя в Е.со и очистка этого белка.
Выводы.
Список используемой литературы


Нитратредуктаза высших растений является одним из наиболее интересных ферментов изза ее центральной роли в ассимиляции неорганического азота, сложной регуляции экспрессии кодирующих ее генов, се каталитической активности и деградации, а также изза индуцибельного характера формирования данного энзима, что делает ее прекрасной моделью для изучения механизмов регуляции работы индивидуальных генов. НР представляет собою гомодимер, состоящий из двух идентичных субъединиц. Каждый мономер состоит из полипептида с молекулярной массой 0 0 кДа, трех кофакторов флавинадениндинуклеотида , гема и молибдоптерина МРТ, а также двух ионов металов и Мо. Ион Мо связан с МРТ, а ион с гемом В. В. . РАБдомен с сайтом окисления ИАВРН. Кофакторы НР образуют внутреннюю цепь передачи электронов от КАЭРН к молекуле нитрата. НР имеет два активных сайта сайт окисления ЫАБРН и сайт восстановления ЫОз. Окисляясь, восстанавливает РАО, РАО передает электроны на цитохром Ь, который восстанавливает МоМРТ. МоМРТ, в свою очередь, восстанавливает нитрат до нитрита. При этом важно, что нитрат может связываться с окисленным ферментом до того, как тот получит электроны от ИАОРН. Это увеличивает скорость протекания такой сложной реакции. Скорость работы нитратредуктазы около 0 оборотов в секунду СатрЬеИ, . У высших растений обнаружено две формы НР ЫАОНспецифичная и ЫАОРНбиспецифичная. Тогда как первая использует в качестве восстановителя только ИАОН, биспецифичная форма может использовать как ЫАЭН, так и ЫАОРН. НАПНзависимая форма является наиболее распространенной формой НР у высших растений 8о1отопп Щ а1. НР высших растений локализована в цитозоле клеток. Во многих растениях НР обнаруживается как в корнях, так и в побегах. При этом ее распределение между корнями и побегами зависит от вида растения и от условий окружающей среды при увеличении концентрации нитрата в почвенном растворе активность НР повышается в том органе, в котором она имелась до данного момента, и появляется в том органе, где она отсутствовала. В некоторых видах растений практически вся НР локализована в корнях клюква, белый клевер, молодые растения цикория, тогда как в других в листьях. Внутри каждого органа растения локализация НР может быть неоднородной. Так, при низкой внешней концентрации нитрата, в корнях НР обнаруживается, главным образом, в эпидермальных клетках и клетках коры, расположенных близко к поверхности корня. При высоких концентрациях нитрата, НР появляется во всех клетках коры и в клетках сосудов. В листьях кукурузы НР обнаруживается в мезофильных клетках, но не в клетках обкладки проводящих пучков ЗоЬшопьоп Щ а1. Восстановление нитрата является весьма энергоемким процессом. Только для восстановления одной молекулы нитрата до аммония тратится 8 электронов. Вследствие этого, до энергии, запасенной в процессе фотосинтеза, расходуется на ассимиляцию нитрата . Процесс восстановления неорганического азота регулируется главным образом на этапе . Активность оказывает существенное влияние на скорость протекания всего азотного метаболизма, а также на эффективность расходования энергии в условиях действия различных внешних и внутренних факторов. Основной путь утилизации нитрата включает следующие этапы активный транспорт или пассивное поглощение нитрата клетками корня его восстановление до аммония в корневой системе или транспорт по растению с последующим восстановлением до аммония ассимиляция аммония с образованием первичных аминокислот, таких как глутамин и глутамат биосинтез других аминокислот и нуклеотидов с последующим новобразованием белка, нуклеиновых кислот и прочих соединений. Однако наряду с описанным выше основным путем утилизации нитрата существует множество модификаций этого пути i . Значительная часть поглощенного нитрата может запасаться в различных тканях растения и клеточных компартментах, прежде всего в вакуолях. Нитрат, запасенный в вакуоле, поддерживает высокую скорость восстановления 3 в цитоплазме, даже в тех случаях, когда скорость его поглощения из окружающей среды ниже скорости его ассимиляции. Параллельно с поглощением нитрата наблюдается поглощение и других форм азота, в первую очередь аммония. Большое количество аммония образуется также в клетках растений в результате фотодыхания.