Особенности структурных белков спор микроспоридии Paranosema grylli, паразитирующей в сверчке Gryllus bimaculatus

• Автор: Семенов, Петр Борисович
• Шифр специальности: 03.00.09
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 117 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список основных сокращений.

Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Своеобразие микроспоридий, как систематической группы внутриклеточных

паразитов в свете современных представлений

1.2.Ультратонкая морфология стадий цикла развития микроспоридий

1.2.1. Жизненные циклы микроспоридий

1.2.2. Характерные особенности ультратонкой морфологии

микроспоридий.

1.2.3. Морфология зрелой споры

1.2.4. Морфология спороплазмы.
1.2.5. Морфология меронта.
1.2.6. Морфология споронта
1.2.7. Морфология споробласта.
1.3. Строение и состав оболочки споры микроспоридий.
1.3.1. Строение экзоспоры.
1.3.2. Строение эндоспоры.
1.3.3 Белки оболочки спор.
1.4. Строение и состав полярной трубки споры микроспоридий
1.4.1. Тонкая морфология полярной трубки
1.4.2. Белки полярной трубки
1.5. Особенности активации и экструзии полярных трубок спор микроспоридий .
1.5.1. Искусственные стимуляторы активации спор.
1.5.2. Механизм активации и экструзии полярных трубок.
1.5.3. Изменения, претерпеваемые полярной трубкой в процессе экструзии
1.6. Особенности взаимоотношений мнкроспоридий с клеткой хозяина
1.7. Особенности гликозилировання белков эукариот.
1.7.1. ЛГгликозилирование
. 7.2. Огликозилирование
1.7.3. Огликозилирование по дрожжевому типу
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследований и методы работы с живыми организмами.
2.2. Методы биохимических исследований
2.3. Методы микроскопических исследований.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Особенности основного белка оболочки спор микроспоридии Рагапозета дгуШ р
3.1.1. Выделение р из спор Р.дуШ
3.1.2. Влияние изменений состава компонентов инкубационной среды раствора 2 и некоторых других факторов на высвобождение р и сопутствующих
белков.
3.1.3. Влияние инкубации спор в растворе 2 на окрашивание оболочки ДАФИ.
3.1.4. Влияние сроков хранения и степени зрелости спор на содержание р в их оболочке, и солюбилизацию этого белка в растворе
3.1.5. Определение локализации рв пробах гомогенатов стадий жизненного цикла Р i с помощью ммуноблотинга
3.1.6. Выявление р в различных фракциях гомогенатов жирового тела зараженных хозяев
3.1.7. Выявление локализации р в клетках паразита и хозяина, иммунофлюоресцентным и илшуноцитохимическим методами
3.1.8. Особенности гликозилирования р.
3.2. Особенности белков полярной трубки микроспоридии Р. гуШ.
3.2.1. Выделение белков полярной трубки из спор.
3.2.2. Влияние различных концентраций компонентов раствора для экстракции на высвобождение предполагаемых БПТ
3.2.3. Получение поликлональной антисыворотки.
3.2.4. Очистка полученной антисыворотки и изучение локализации предполагаемых БПТ в клетках микроспоридии методом иммуноблоттинга.
3.2.5. Выявление локализации БПТметодом иммуннофлюоресцентного
анализа.
3.2.6. Определение локализации БПТметодом иммунной электронной микроскопии.
3.2.7. Выявление присутствия БПТв составе оболочки спор методом иммуноблоттинга.
3.2.8. Особенности гликозилирования БПТ1.
3.3. Белковый состав оболочки спор как видоспецифичный признаку
микроспоридий
Выводы.
Список использованной литературы


Изучение упомянутых белков также может послужить ключом к пониманию еще очень мало изученных и уникальных закономерностей функционирования клетки микроспоридий, таких, например, как биосинтез, созревания и транспорт белковых молекул. Кроме того, наиболее сильное патогенное воздействие этих паразитов на организм хозяина и оказываемые микроспоридиями дистантные эффекты на его репродуктивную и иммунную системы отмечаются на заключительном этапе спорогенеза, когда подавляющее большинство особей паразита представлено зрелыми спорами Селезнев , Токарев . Упомянутые моменты несомненно связаны с уникальными структурными особенностями споры микроспоридий, что обусловливает актуальность изучения структурных белков споре точки зрения паразитохозяинных взаимоотношений. Оболочка обеспечивает возможность создания внутри споры высокого гидростатического давления движущей силы выброса полярной трубки. Оболочка защищает спору от разрушающего воздействия внешних факторов при сохранении се в окружающей среде. За счет другой органеллы аппарата экструзии полярной трубки осуществляется проникновение в клетку хозяина инвазионного начала ключевой этап реализации функционального предназначения споры. Таким образом, структурные белки, входящие в состав оболочки и полярной трубки споры представляют особенный интерес. К моменту начала экспериментальной работы, результаты которой легли в основу настоящей диссертации, не было ни одной публикации, затрагивающей тему структурных белков энтомопатогенных микроспоридий. Кроме того, достаточно актуальной остается проблема диагностики видов микроспоридий паразитирующих в насекомых и представляющих интерес для защиты растений. По современным требованиям световое микроскопирование уже не решает данной проблемы. Дорогостоящие и трудоемкие тесты, включающие элетронную микроскопию и ПЦРдиагностику, могли бы быть заменены анализом состава белков оболочки спор, что значительно проще методически. Таким образом, в связи со сказанным выше, целью настоящей работы явилось исследование структурных белков спор микроспоридии Рагапозета i, играющих ключевую роль в патогенезе микросноридиоза сверчка Сгуш Ытасикаиз основного белка оболочки и белков полярной трубки. Разработать метод выделения и очистки основного белка оболочки и белков полярной трубки спор Р. Исследовать влияние процесса экструзии, условий хранения на состав белков оболочки спор и изучить возможность использования полученных показателей дтя оценки их жизнеспособности. Определить внутриклеточную локализацию выделенных структурных белков на разных стадиях развития паразита, выявить особенности гликозилирования их молекул, а также возможную роль данных белков в паразитхозяинных отношениях. Разработать метод диагностики морфологически сходных видов микроспоридий на примере рода Рагапозета, основывающийся на анализе состава белков оболочки спор. Глава 1. Своеобразие микроспоридий, как систематической группы внутриклеточных паразитов в свете современных представлений. До недавнего времени наиболее популярной была точка зрения об исключительной древности микроспоридий и близости их к прокариотам. Исси, , Vi . Так, представители данной группы обладают наименьшим из известных среди эукариот размером генома у i он составляет всего т. Насонова и др. Ii i, Vi . Анализ нуклеотидных последовательностей фактора элонгации трансляции , также мог бы свидетельствовать об эволюционной близости микроспоридий и прокариот i . Однако результаты недавних исследований в области молекулярной биологии дают основание предполагать, что эти организмы, скорее всего, не являются древнейшими среди эукариот. На это указывает наличие в геноме микроспоридий отдельных кодирующих участков для тимидилат синтазы и дигидрофолат редуктазы Viv . РНКполимеразы II микроспоридий и грибов i, i, i, . В пользу гипотезы о происхождении грибов и микроспоридий от общего предка, обретающей в последнее время все большую популярность, также свидетельствует ряд очевидных сходств в характере последовательностей теломерных повторов у дрожжей , i, v и микросиоридии i ii. Эти данные представляют особый интерес в связи с тем, что теломерные повторы дрожжевых грибов существенно отличаются от таковых других эукариот.