Основные механизмы конституционального иммунитета насекомых

• Автор: Глупов, Виктор Вячеславович
• Шифр специальности: 03.00.09
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 326 с. : ил.

Введение

Глава 1. Материалы и методы

1.1. Насекомые.

1.2. Энтомопатогенные микроорганизмы и методы заражения насекомых.

1.3. Приборы и реактивы

1.4. Исследование зараженных тканей насекомых

1.5. Отбор гемолимфы и приготовление гомогенатов

внутренних органов

1.6. Определение активности и спектра неспецифических

эстераз, активности глутатионБтрансферазы. .

1.7. Определение продукции активированных кислородных

метаболитов
1.8. Определение активности су перокси ддисму та зы и
концентрации тиолсодержащих соединений.
1.9. Определение паттернраспознаюцих белков.
1.9.1. Определение агглютинрующей активности гемолимфы капустной совки. .
1.9.2. Определение паттернраспознаюших белков в
гемолимфе большой вощиной моли
1 Определение белка.
1 Статистическая обработка
экспериментальных данных
Глава 2. Генерация активированных кислородных
метаболитов у насекомых и ее изменение
при различных патогенезах.
2.1. Источники и основные свойства АКМ.
2.1.1. Строение и свойства АКМ.
2.1.3. Источники АКМ в организме
2.1.4. Фенолоксидазоактивирукхцая система.
2.2. Методические подходы при изучении активированных
кислородсодержащих метаболитов
2.2.1. Люминолзависимая хемилюминесценция
2.2.2. Метод восстановления нитросинего
тетразолия НСТ
2.2.2.1. Влияние активаторов фагоцитоза на
восстановление нитросинего тетразолиевого в гемоцитах насекомых
2.2.2.2. Влияние ингибиторов на восстановление НСТ
в гемоцитах насекомых
2.2.3. Метод спиновых ловушек.
2.3. Генерация активированных кислородных метаболитов при различных патогенезах.
2.3.1. Образование АКМ при микроспоридиозе насекомых
2.3.1.1. Влияние микроспоридиоза на фенолоксидазную активность гемолимфы
2.3.1.2. Влияние микроспоридиоза на восстановление нитросинего тетразолия в гемоцитах личинок
С. теопеа
2.3.1.3. Окисление СРН гемолимфой личинок С. теопеа при микроспоридиозе.
2.3.2. Изменение продукции АКМ насекомых
при бактериозах.
2.3.2.1. Изменение продукции АКМ при инъекции бактерий в
гемоцель насекомых
2.3.2.2. Изменение продукции АКМ у личинок . теопеа в течение бактериоза.
2.3.3. Изменение продукции АКМ насекомых при микозах.
2.3.4. Заключение.
Глава 3. Детоксицирующие ферменты насекомых.
3.1.1. Микросомальные монооксигеназы
3.1.2. Неспецифические эстеразы насекомых
3.1.3. ГлутатионБтрансферазы.
3.1.4. Факторы, влияющие на активность детоксицирующих ферментов
3.2. Изменение активности детоксицирующих ферментов
насекомых при патогенезе .
3.2.1. Влияние микроспоридиоза на спектр
и активность неспецифических эстераз.
3.2.1.1. Изменение активности и спектра
зстераз гемолимфы . теопеа
3.2.1.2. Изменение активности и
спектра эстераз жирового тела С. теопеа
3.2.1.3. Изменение активности и спектра эстераз среднего кишечника личинок . теопеа .
3.2.1.4. Типирование неспецифических эстераз
3.2.1.5. Влияние микроспоридиоза на активность
глутатионБтрансфераз.
3.3. Влияние микозов на спектр и
активность неспецифических эстераз
3.3.1. Типирование неспецифических эстераз при микозах.
3.3.2. Влияние микозов на спектр и активность
V
глутатион трансфераз и микросомальных
монооксигеназ
3.3.4. Изменение чувствительности . к
инсектицидам при микозах
3.5. Влияние кристаллообразуюцих бактерий на спектр и активность неспецифических эстераз личинок большой вощиной моли.
3.5. Заключение
Глава 4. Антиоксидантная система насекомых.
4.1. Ферментативные антиоксиданты.
4.2. Неферментативные антиоксиданты
4.3. Активность антиоксидантов в тканях личинок
. при различных заболеваниях
4.3.1. Влияние микроспоридиоза на активность
супероксидцисмутазы.
4.3.2. Изменение концентрации тиолсодержащих соединений в гемолимфе . при микроспоридиозе
4.3.3. Уровень и активность антиоксидантов в кишечнике личинок . при перроральном инфицировании бактериями i iii .i
4.4. Заключение
Глава 5. Паттернраспознаюцие белки насекомых
5.1. Агглютинины капустной совки
5.2. Паттернраспознаюцие белки большой вощиной огневки.
Заключение
Выводы
Список литературы


После удаления козьей сыворотки монослои инкубировали в течение 1 ч в кроличьей антисыворотки к агглютининам совки разведение 1, содержащей 3 бычьего сьюороточного альбумина БСА и 0юЗ Тритона Х0. Затем монослои трех кратно промывали в ФБ с 0. I кролика, конъюгированных с пероксидазой Имтек, Москва в разведении 1. После трехкратного промывания в ФБ без детергента, монослои инкубировали в ФБ с 0. ДАБ, содержащем 0. Н2. Все описанные операции проводили при температуре 2С. Для приготовления аффинного сорбента бромциан ак
тивированную Сефарозу 4В конъюгировали с I кролика согласно i,Ii. Сывороточные I кролика были очищены согласно Трукко, де Петрис . При проведении аффинной хроматографии использовали фракции гемолимфы, полученные после гельфильтрации. Электрофоретический анализ в пластинах полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия и без нег проводили по методу i . Окрашивание гелей проводили в 0. Полученную гемолимфу от личинок инкубировали с различными тест микроорганизмами бактерии, энтомопатогенные грибы 8 клетокмл при температуре С в течение 4 ч. Затем проинкубированные микроорганизмы трижды промывали в ФБ, после чего инкубировали в 0. М в ФБ. Полученный сепернатант, содержащий ПРБ, трижды диализировали против ФБ и использовали в дальнейших экспериментах. Для изучения реакции распластывания суспензию гемоцитов в ФБ с ПРБ ин кубировали мин. В качестве контроля использовали ФБ. Подобным образом инкубировали с раствором НСТ и ПРБ. Концентрацию белка в гемолимфе и в гомогенатах определяли по методу М. Бредфорда , . Для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин. Полученные данные обрабатывали статистически, рассчитывая среднее арифметическое и его ошибку. Для проверки нормальности распределения данных использовали V критерий ШапироУилка. Статистическую значимость различий определяли по критерию Стъюдента Плохинский, . Также экспериментальные данные обрабатывали дисперсионным анализом по Б. А. Доспехову . Нулевую гипотезу об отсутствии различия между вариантами отвергали, если хх х2 г НСР, где хг и х2 частные средние, НСР наименьшая существенная разница. Расчет коэффициентов корреляции также проводили по Б. А. Доспехову. Механизмы, с помощью которых происходит уничтожение чужеродных клеток, а также собственных клеток организма насекомых, можно разделить на два типа. Первый связан с образованием высокореакционных активированных кислородных метаболитов АКМ, которые способны вызывать гибель клетокмишеней. Под активированными кислородными метаболитами подразумевают широкий класс высокореакционных кислородных соединений радикальной и нерадикальной природы, образующихся в результате неполного восстановления молекулярного кислорода или изменения спина одного из его электронов, находящихся на внешних орбиталях Зенков и др. Второй это синтез различных белков иили гликопротеинов, которые могут непосредственно вызывать структурные изменения в проникшем паразите. Владимиров и др. Зенков и др. Среди них большое количество является радикалами. Свободным радикалом называется частица атом или молекула, имеющая на внешней орбитали один или несколько неспаренных электронов. Образование радикалов обусловлено появлением на свободной валентной орбитали нового электрона или, наоборот, удалением одного электрона из электронной пары. Эти процессы обычно происходят в результате реакций окисления или восстановления. Если электроны принадлежат к разным атомам и образуют между ними химическую связь, то разъединение этих электронов, т. Зенков и др. Основные формы АКМ включают з себя супероксидный анионрадикал , синглетный кислород г, озон , перекись водорода Н2О2, гидроксильный радикал НО, оксид азота 0, гипогалоиды НОХ, где ХС1, , I, , алкоксильные 0 и перекисные радикалы Зенков и др. Последние представляют собой гетерогенный класс соединений. Образование супероксиданиона или его протонированной формы гидродиоксида в биологических системах происходит в результате одноэлектронного восстановления молекулы кислорода .