Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованием поли- и моноклональных антител

• Автор: Федорова, Валентина Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 318 с. : 20 ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 1. Материалы и методы

1.1. Штаммы микроорганизмов

1.2. Антигены

1.3. Клеточные линии.

1.4. Культуральные среды.

1.5. Реактивы и буферные растворы

1.6. Оборудование и приборы

1.7. Методы иммуноанализа

1.8. Лабораторные животные.
1.9. Статистические методы.
Глава 2. Иммунохимическая характеристика капсульных антигенов
. i и V с i в
2.1. Изучение природы антигенных детерминантов, определяющих серологическую активность
Ф1 чумного микроба
2.2. Иммунореактивность капсульного антигена штаммов
.i, дефектных по гену .
2.3. Иммунобиологические свойства капсульного антигена
V. серо вара
2.4. Обсуждение результатов.
Глава 3. Особенности антигенной структуры углеводных компонентов
чумного микроба и холерного вибриона сероварнанта
3.1. Изучение особенностей экспрессии антигенных детерминантов Л ПС у штаммов .i с
разным плазмидным профилем
3.2. Выявление антигенных детерминантов ЛПС, липида А и ОСА чумного микроба с помощью поли
и моноклональных антител
3.3. Иммунохимическая характеристика ЛПС V. и диагностическая значимость
полученных к нему антител
3.4. Обсуждение результатов.
Глава 4. Изучение иммуногснности и специфичности белков,
кодируемых чумного микроба
4.1. Определение спектра полипептидов, детерминируемых возбудителя чумы, в условиях их максимальной экспрессии.
4.2. Сравнительное изучение иммуногенных свойств отдельных антигенов белковой природы,
кодируемых .i.
4.3. Получение и характеристика моноклональных антител
к белкам, экспрессируемым чумного микроба.
4.4. Аффинная очистка и иммунохимическая характеристика некоторых белков, кодируемых .i.
4.5. Обсуждение результатов.
Глава 5. Иммунохимическая характеристика фибринолизина .i
с помощью панели моноклональных антител
5.1. Получение и характеристика антителопродуцирующих
гибридом.
5.2. Функциональные и иммуиохимические свойства МКА, направленных к различным антигенным детерминантам фибринолизина .i.
5.3. Конструирование экспериментальных диагностических тестсистем ТИФА и МФА для выявления и дифференциации
штаммов чумного микроба независимо от температуры их
культивирования
5.4. Обсуждение результатов
Глава 6. Получение и прикладное значение антиидиотипических
антител к антигенам возбудителя чумы
6.1. Стратегия иммунизации и выбор лабораторных животных для индукции антиидиотипических антител против
антигенов чумного микроба
6.2. Критерии установления вида антиидиотипических
антител
6.2.1. Иммунохимический критерий
6.2.2. Иммунологический критерий
6.2.3. Функциональный критерий
6.3. Экспериментальное обоснование возможности применения антиидиотипических антител для разработки противочумных вакцин нового поколения.
6.4. Экспериментальные иммуноглобулиновые тестсистемы на основе антиидиотипических антител как аналоги
антигенных диагностических препаратов
6.5. Обсуждение результатов
Глава 7. Перспектива использования мышиных поли и моноклональных антител для разработки диагностических
тестсистем
7.1. Панель моноклональных антител для лабораторной диагностики чумы и определения полипептидов,
кодируемых плазмидами чумного микроба
7.2. Оптимизация условий получения поликлональных моиоспецифических иммуноглобулинов к антигенам возбудителей чумы и холеры.
7.3. Обсуждение результатов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


После отмывки дистиллированной водой и подсушивания в вертикальном положении, на предметные стекла наносили мкп глицерина, забуференного карбонатнобикарбонатным буфером, накрывали покровным стеклом и подготовленные образцы просматривали с помошью микроскопа МЛ2 под иммерсией, используя кедровое масло. Учет результатов проводили визуально, считая специфичным свечение образцов на 3 и 4 креста. Люминесценцию на креста считали неспецифической. Электрофоретическое разделение препаратов водорастворимых белков штаммов . V НИИЭГ, КМ7, КМ8, выращенных на средах с тМ 2 8, цельноклеточных лизатов V. Т.М. Ф1, i и ЛПС чумного микроба, ЛПС и Оантигенов холерного вибриона проводили в полиакриламидном геле, содержащем до деци л сульфат натрия ПААГ по методу i 0. Для этого мкл каждого образца кипятили 2 мин на водяной бане в буфере, содержащем 0,5 М ТрисНС1, глицина, 2меркаптоэтанола и 4 , затем смешивали vv с 0,1 раствором бромфенолового синего и вносили в кармашки концентрирующего геля. В работе использовали 4 концентрирующий гель, состоящий из 4 Т, 2,7 С 0,5 М ТрисНС1, 6,8, 0,1 , 0, персульфата аммония,
0, . Разделение образцов проводили в геле 7 Т, 2, С 0,5 М ТрисНС1, 8,8, 0,1 , 0,1 персульфата аммония и 0, . Электрофорез вели при 8,3 в буфере, содержащем шМ Трис, 0,2 шМ глицина и 0, при силе тока гпА в концентрирующем геле и шА в разделяющем геле при напряжении 0 V. При достижении фракциями конца геля электрофорез прекращали, а гель переносили для окрашивания белков в 0,5 раствор i ii 0 в этаноле с уксусной кислоты на ночь. Затем гель помещали в тот же раствор, но без красителя для обесцвечивания на 3 ч, после чего высушивали. Окрашивание ЛПС и углеводных компонентов бактерий проводили по Н. С.М. Для этого ЛПС фиксировали на геле после окончания электрофореза при комнатной температуре в смеси этанола и 7 СН3СООН vv. После окисления в течение 5 мин в 0, йодной кислоте с 4 мл изопропанола с 7 уксусной кислоты vv гель отмывали в большом объеме дистиллированной воды при перемешивании. М раствора . Образовавшийся после смешивания этих растворов бурый осадок титровали 4. Гель помещали в полученный раствор на мин с последующей 4кратной отмывкой дистиллированной водой. Электрофоретические профили проявляли 1, раствором формальдегида, подкисленного 0,4 лимонной кислотой, в течение мин при перемешивании. Реакцию останавливали 5 уксусной кислотой при вымачивании в ней геля. Для длительного хранения гель обрабатывали 0,5 глицерином и высушивали. Иммуноблот с образцами культуральной жидкости или выделенных из нее различных клонов гибридом, МКА к Ф, X, антителами к ЛПС и Кантигену V проводили с помощью аппарата для полусухого блота с графитовыми электродами. Для этого после предварительного электрофоретического и хроматографического разделения антигены переносили в течение 1 ч с использованием буфера переноса шМ Трис, 2 шМ глицин и метанол, 8,3, на нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0, мкм i. Перенесенные фракции фиксировали при 0 С в течение мин и инкубировали с 0,5 мин при С для блокировки свободных сайтов. Мембрану оставляли на ч при 4 С с образцами антител с последующим проявлением конъюгатом протеина А с пероксидазой хрена , кроличьими антимышиными иммуноглобулинами, меченными тем же ферментом НИИЭМ им. Ф. Гамалеи, а также белком А, связанным с коллоидным золотом, любезно предоставленным сотрудниками Института биологии и физиологии растений и микроорганизмов АН РФ г. Саратов, в рабочем разведении. В качестве субстрата использовали 4хлор1нафтол и диаминобензидин. I мл метанола с последующим добавлением 9 мл , 7,5, и 5 мкл Н2О2. Мембрану помещали в этот раствор на мин до появления специфических реплик. Отмывку мембраны после блокировки, инкубирования с образцами и окрашивания конъюгатами проводили фосфатным буфером, 7,,4, в течение мин при перемешивании. I.8. Синтез Влимфоцитами антител к отдельным белкам, кодируемым , ЛГ1С и i . X.3. Мыши указанной линии были также использованы в качестве продуцентов МКА, поликлональных, моноспецифических и антиидиотипических антител, необходимых при выполнении различных этапов работы. Источником специфических антител к ЛПС V. АИТ к ЛПС и детерминируемым белкам . Шиншилла весом 1, кг.