Разработка методического подхода к генетическому типированию штаммов сибиреязвенного микроба

• Автор: Цыганкова, Елена Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 181 с. : ил.

1.1. Характеристика генома сибиреязвенного микроба

1.2. Методы генетического типирования В. i и молекулярное разнообразие штаммов

1.3. Теоретические и практические аспекты генетического типирования

возбудителя сибирской язвы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы.

2.1.1. Бактериальные штаммы

2.1.2. Реактивы и питательные среды

2.1.3. Лабораторное оборудование.

2.1.4. Программное обеспечение.

2.2. Методы
2.2.1. Фенотипические свойства штаммов.
2.2.2. Приготовление проб ДНК
2.2.3. Метод отбора колониальноморфологических вариантов штаммов
В. i.
2.2.4.Метод анализа нуклеотидной последовательности гена ПА
2.2.5. Метод рестрикционного анализа.
2.2.6. Метод выявления областей генома с тандемными повторами
2.2.7. Метод многолокусного анализа областей генома .
2.2.8. Методы статистической обработки материала.
ГЛАВА 3. ОБНАРУЖЕНИЕ И АНАЛИЗ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОМА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА С ТАНДЕМНЫМИ И ЕДИНИЧНЫМИ НУКЛЕОТИДНЫМИ ПОВТОРАМИ.
3.1. Поиск областей с тандемными повторами в геноме .i
3.2 Идентификация и анализ новых Vлокусов в геноме .i
3.3. Поиск и анализ областей генома В. i с единичными
нуклеотидными повторами.
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДА АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИНЫ АМПЛИФИКАЦИОННОРЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ ГЕНА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА В. I
4.1 Анализ i ii полиморфизма единичных нуклеотидных повторов
в гене ПА сибиреязвеннного микроба
4.2 Подбор эндонуклеаз с сайтами рестрикции в пределах гена ПА и условий ПЦР с праймерами к области этого гена
сибиреязвенного микроба.
4.3 Оптимизация набора эндонуклеаз и условий рестрикции для анализа гена ПА и анализ полученных результатов
4.4. Распределение типов гена ПА по источнику выделения
и географическим регионам
ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКОГО ПОДХОДА К ГЕНОТИПИРОВАНИЮ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА, ОСНОВАННОГО НА СОЧЕТАННОМ ПРИМЕНЕНИИ V, , АНАЛИЗА ГЕНА ПА И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ МЕТОДОВ.
5.1. Генотипирование штаммов В. i с использованием V
5.2. Использование V в сочетании с анализом гена ПЛ
5.3. Использование локусов для выявления дополнительного
генетического разнообразия.
ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Многочисленные работы того времени свидетельствуют о том, что высокий уровень вирулентности В. С.В. Ivi В. Е., , i I. Успешному изучению роли илазмидных и хромосомных детерминант патогенности В. С.В. СР СР, способных к переносу генетического материала между видами группы В. В. i, В. В. iii С. В., , , , . Используя фаг , исследователям удалось осуществить трансдукцию плазхмиды рХ в клетки штамма В. В. i, которые стали продуцировать полиИглутаминовую капсулу . В. i и В. На плазмиде X локализованы гены , и суа, экспрессия которых обеспечивает синтез экзотоксинов, вместе с капсулой относящихся к основным факторами вирулентности. Согласно данным Т. М. i, , гены и располагаются рядом друг с другом, а ген суа на расстоянии т. Ген отвечает за синтез протективного антигена ПА, связывающегося с поверхностными рецепторами клеткимишени и обеспечивающего проникновение в клетки каталитически активных белков. Ген кодирует один из них летальный фактор ЛФ, а ген суа отечный фактор ОФ, составляющие в комбинации с ПА летальный и отечный токсины , i . В структуре генетических локусов, кодирующих синтез ЛФ и ОФ, а также ПА, прослеживается немало общих черт идентичность последовательностей ШайнаДельгарно, наличие участков, кодирующих синтез сигнальных пептидов, содержание ГЦпар в пределах , отсутствие триплетов, кодирующих цистеин. X последовательностей, сходных с геном vi у В. III у В. X открытых рамок считывания, кодирующих Iподобные элементы. Гены, кодирующие синтез ОФ, ЛФ и ПА, находятся в центре острова патогенности плазмиды X i В. Р., . С.В. Т. . В. i из Флориды содержит смссь обеих ориентаций. На плазмиде X, по данным ряда авторов , , i . I. i . Да, кодируемый геном x. С имеет место только при наличии гена x Т. М. . В то же время . С, а повышенная температура С. Позднее появились работа I. В, расположеного на плазмиде рХ. Практически одновременно на плазмиде X был обнаружен ген x, кодирующий белокрепрессор x, который в отсутствии С блокирует транскрипцию гена x или структурных генов, осуществляя тем самым негативную Сзависимую регуляцию экспрессии структурных генов компонентов токсинов i I. Кроме того, существует репрессор транскрипции протективного антигена , который, возможно, также принимает участие в регуляции генов i и суа , Т. М., . Более детальное изучение роли регуляторного гена x в реализации патогенных и вирулентных свойств В. V, iv при изучении действия глицерол монолаурата на рост В. РНК , суа, были значительно понижены, в то время как уровень иРНК x был выше своих обычных значений. Эти данные позволили авторам выдвинуть предположение о существовании независимых от x механизмов регуляции вирулентности В. Таким образом, наличие двух регуляторных генов и x, может контролировать уровень экспресии генов, кодирующих синтез компонентов сибиреязвенного экзотоксина, определяя уровень и момент начала их синтеза. С самого начала молекулярногенетических исследований В. Еще в г. Оглутаминовой кислоты, локализованы на плазмиде рХ, что позднее было подтверждено другими исследователями i I. Секвенировав соответствующий участок ДНК, i . В, сарС, сарА, детерминирующих синтез белков СарВ, СарС, СарА, соответственно. В совокупности эти ферменты образуют ассоциированный с мембраной комплекс, последовательно осуществляющий активацию, полимеризацию изомера глутаминовой кислоты и ее выделение на поверхность микробной клетки. Позже был идентифицирован четвертый ген, входящий в оперон биосинтеза капсулы . Кодируемый им белок требуется для ковалентной связи полиглутамата с пептидогликаном. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей позволил отнести белок к гаммаглутамилтранспептидазам. Специально сконструированный мутантный штамм, не продуцирующий белок , является намного менее вирулентным, чем исходный родительский штамм. Практически сразу же после гена был обнаружен еще один ген, сарЕ входящий в оперон Т. М., . Как и гены сарВ, сарС и сарА, сарЕ является структурным геном и кодирует синтез пептида СарЕ, состоящего из аминокислотных остатков.