Разработка амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей кокцидиоидомикоза

• Автор: Гришина, Марина Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Саратов
• Количество страниц: 102 с. : 30 ил.

СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологические свойства возбудителей кокцидиоидомикоза, эпидемиология и патогенез заболевания

1.2. Таксономическое положение iii. шгпШб и iii ро5асЬзИ

1.3. Лабораторная диагностика кокцидиоидомикоза

1.4. ДНК диагностика особо опасных микозов СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе

2.2. Питательные среды и условия культивирования микроорганизмов

2.3. Обеззараживание материала, содержащего возбудителей ООИ

2.4. Подготовка проб для постановки реакции амплификации

2.5. Методы выделения ДНК
2.6. Выбор и синтез олигонуклеотидных праймеров
2.7. Постановка полимеразной цепной реакции
2.8. Секвснирование продуктов амплификации
2.9. Проведение электрофореза и детекция продуктов амплификации
2 Заражение лабораторных животных
2. .Статистическая обработка данных
ГЛАВА 3. ПОДБОР ПРАЙМЕРОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ
3.1. Анализ нуклеотидных последовательностей и конструирование ви доспецифических праймеров
3.2. Выбор оптимальных условий для постановки полимеразной цепной реакции
ГЛАВА 4. ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОКЦИДИОИДОМИКОЗ А
4.1. Разработка способа обеззараживания материала содержащего воз будителей кокцидиоидомикоза
4.2 Оптимизация метода выделения ДНК из чистых культур возбуди телей кокцидиоидомикоза для проведения ПЦР
4.3. Выделение ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза из искусственно
контаминированных проб
ГЛАВА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ВЫБРАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ЗАТРАВОК
5.1. Генотипическая дифференциация штаммов возбудителей кокци диоидомикоза, находящихся в Коллекционном центре Волгоградского научноисследовательского противочумного института
5.2. Определение аналитической специфичности и чувствительности выбранных олигонуклеотидных затравок
ГЛАВА 6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕ
АКЦИИ Д ЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОКЦИДИОИДОМИКОЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Определить видовую принадлежность штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза, предоставленных Коллекционным центром Волгоградского научноисследовательского противочумного института, с помощью методов генетического типирования. Установить оптимальные способы обеззараживания материала и подготовки проб при исследовании объектов внешней среды и биологического материала, контаминированных возбудителями кокцидиоидомикоза. Оценить эффективность сконструированной тестсистемы для детекции возбудителей в объектах внешней среды и диагностики экспериментального кокцидиоидомикоза. Впервые разработана отечественная амплификационная тестсистема для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза на основе фрагмента гена макрофагсвязаннот протеина СлттШ и на основе фрагмента гена гликопротеина внешней стенки сферул С. БасаБП. Показана ее эффективность при обнаружении ДНК грибов в объектах, искусственно контаминированных штаммами СоссШюШеБ ярр. Олигонуклеотидные праймеры СтМВРХз атМВР2оБ обеспечивают специфическую амплификацию обоих возбудителей кокцидиоидомикоза, а праймеры СрЯОШ2Б СрЗОШ2аБ только С. Бас1азН. Схема лабораторной диагностики кокцидиоидомикоза дополнена этапами ПЦР как при идентификации чистых культур С. Бас1аБИ и СЛттйю, так и исследовании экспериментального клинического материала и проб из объектов внешней среды. На основе результатов внутривидового генетического типирования и анализа культур СосскИоШез Брр. ПЦР с использованием двух пар праймеров, определена видовая принадлежность коллекционных штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза. Предложен способ выделения ДНК возбудителей особо опасных микозов из контаминированных проб почвы и клинических образцов, обеспечивающий высокоэффективный лизис клеток патогенных грибов с последующей очисткой ДНК. Приоритетность исследований подтверждена положительным решением о выдаче патента на изобретение Способ выделения ДНК СосЫЛШЛеБ ши для проведения полимеразной цепной реакции от . Сконструированная амплификационная тестсистема может быть использована в специализированных лабораториях для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза. На сегодняшний день предложенные праймеры используют в лабораториях Волгоградского научноисследовательского противочумного института для анализа музейных штаммов СоссШюШез ьрр. Материалы диссертации включены в лекционный материал, предназначенный для врачей, биологов и лаборантов учреждений санитарноэпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий при проведении первичной специализации и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации, лабораторной диагностики особо опасных заболеваний и противодействию биотерроризму. По результатам диссертационной работы составлены методические рекомендации Способ обеззараживания материала, зараженного возбудителями кокцидиоидомикоза, для проведения полимеразной цепной реакции и Использование олигонуклеотидных праймеров СшМВРХз атМВР2аз и СрБО ЪЪ СрЗОЦЫаэ для идентификации и дифференциации возбудителей кокцидиоидомикоза, одобренных Ученым советом Волгоградского научноисследовательского противочумного института протокол 5 от г. С.роваАазИ. С.роааАсяп, обладает чувствительностью 1x4 артроспормл при анализе чистых культур микромицетов. Обработка проб раствором мертиолятом натрия до конечной концентрации 1 позволяет проводить обеззараживание материала, содержащего возбудителей кокцидиоидомикоза, для его исследования методом ПЦР без снижения чувствительности реакции амплификации. Экстракция ДНК грибов с помощью гуанидинтиоцианатфенолхлороформного метода с последующей нуклеосорбцией является эффективным способом подготовки проб при исследовании объектов внешней среды и биологического материала методом ПЦР. Разработанная амплификационная тестсистема с праймерами С1тМВР 1 СтМВР2аз и СрУ Ср1 Сконструированная тестсистема позволяет специфически детектировать САттНи и С. АаьИ с чувствительностью 1x4 артроспормл при исследовании объектов внешней среды почвы, искусственно контаминированных возбудителями кокцидиоидомикоза.