Молекулярная детекция и разнообразие Crenarchaeota в наземных горячих источниках

• Автор: Перевалова, Анна Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 171 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Термофильные микроорганизмы

1. Определение термофильных и гипертермофильных микроорганизмов.

2. Местообитания термофильных микроорганизмов

Глава II. Новая эра в микробиологии применение

молекулярных подходов и новая таксономия

1. Использование молекулярнобиологических подходов к исследованию структуры микробных сообществ.
1.1 Роль молекулы рРНК в таксономии и филогении
1.2 Методы молекулярной экологии для исследования
микробных сообществ, их достоинства и недостатки.
1.2.1 Схема проведения исследований
1.2.2 Выделение нуклеиновых кислот.
1.2.3 ПЦР со специфичными праймерами.
1.2.4 Денатурирующий градиентный гельэлектрофорез .
1.2.5 Гибридизация ii I.
2. Комбинация традиционных микробиологических методов и современных
молекулярных подходов.
Глава 1. Археи
1. Культивируемые термофильные
1.1Порядок
1.2 Род
2. Некультивируемые .
2.1 Нетермофильные
2.2 Термофильные некультивируемые .
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава I. Материалы и методы, объекты исследования
1. Характеристика мест отбора проб
1.1 Полуостров Камчатка.
1.2 Остров Кунашир
1.3 Байкальский регион
1.4 Исландия
2. Отбор проб
3. Объекты исследования
4. Культивирование.
5. Молекулярные методы.
5.1 Выделение ДНК
5.2 ПЦР.
5.3 Электрофорез в агарозном геле.
5.4 Гибридизация с олигонуклеотидными зондами.
5.4.1 Подбор олигонуклеотидных зондов
5.4.2 Мечение олигонуклеоидных зондов.
5.4.3 Метод Саузерна
5.4.4 Проведение реакции предгибридизации.
5.4.5 Проведение реакции гибридизации.
5.4.6 Детекция определение сигнала
iмеченых олигонуклеотидных зондов.
5.5
5.5.1 Амплификация ДНК для
5.5.2 Денатурирующий градиентный гельэлектрофорез
5.6 Филогенетический анализ.
5.6.1 Секвенирование
5.6.2 Построение филогенетических деревьев
5.7 Определение ГЦ состава
5.8 Флюоресцентная гибридизация i i I.
5.8.1 Фиксация культур клеток.
5.8.2 Фиксация природных образцов.
5.8.3 Гибридизация
6. Методы микроскопии
6.1 Световая микроскопия
6.2 Электронная микроскопия
6.3 Флюоресцентная микроскопия.
Глава II. Результаты и обсуждение
1. Молекулярная детекция представителей
1.1 Проверка специфичности праймеров .
1.2 Детекция представителей в природных пробах.
1.2.1 Распространение представителей в наземных гидротермах
1.2.2 I специфичными зондами
1.2.3 Идентификация обнаруженных .
1.3 Детекция гипертермофильных архей рода
путем гибридизации с олигонуклеотидными зондами.
1.3.1 Подбор олигонуклеотидных зондов.
1.3.2 Проверка специфичности олигонуклеотидных зондов.
1.3.3 Идентификация чистых культур организмов.
1.3.4 Детекция представителей рода в накопительных культурах.
1.3.5 Детекция представителей рода в
природных пробах
2. Выделение и характеристика новых представителей
2.1 Характеристика . vИЗ
2.1.1 Морфология и ультраструктура
2.1.2 Физиологические характеристики
2.1.3 Генотипические свойства и филогенетическое положение штамма Т
2.1.4 Диагноз . v.
2.1.5 Уточнение описания рода
2.2 Выделение и характеристика vi i . v., . v
2.3 Характеристика новых , содержащихся в накопительных культурах из горячих источников Байкала и Камчатки
2.3.1 Характеристика из ист. Уринский Байкальский регион
2.3.2 Характеристика новых из
накопительных культур кальдеры Узон
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИЛОЖЕНИЕ
Материалы
1. Микроорганизмы
2. Ферменты и коммерческие киты
3. Синтетические олигонуклеотиды
4. Молекулярные маркеры
5. Синтетические среды для культивирования микроорганизмов
6. Буфера и растворы
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Некоторые этапы работы были выполнены во время стажировки по программе для молодых ученых ИНТАС в лаборатории микробиологии Бергенского Университета под научным руководством НильсаКоре Биркеланда Берген, Норвегия. Подбор олигонуклеотидных праймеров и зондов был проведен совместно с к. Лебединским ИНМИ РАН. Определение состава ГЦ пар в ДНК и ДНКДНК гибридизацию выполняли совместно с к. А.М. Лысенко и к. Черных ИНМИ РАН. Анализ последовательностей рРНК чистых культур микроорганизмов, а также ПЦР продуктов проводили совместно с к. Б.Б. Кузнецовым, к. Т.В. Колгановой Центр Биоинженерии РАН и к. Т.П. Туровой ИНМИ РАН. Электронную микроскопию чистых культур микроорганизмов выполнила Кострикина ИНМИ РАН. Автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам и друзьям, принимавшим участие на разных этапах работы. Автор выражает признательность к. Черных за помощь в освоении молекулярных методов, а также к. Лебединскому за критический научный подход ко всем этапам молекулярной работы. Особую благодарность автор выражает научному руководителю д. Е.А. Финансовая поддержка. Работа была поддержана Программами РАН Молекулярная и клеточная биология, Биоразнообразие и Эволюция биосферы, проектами РФФИ 4, 2, 0, программами ИНТАС , 0 и . А.А. Перевалова, А. В. Лебединский, Е. А. БончОсмоловская, Н. А. Черных. Детекция гипертермофильных архей рода ii путем гибридизации с олигонуклеотидными зондами. Микробиология, 3 . А.А. V vi, I. V. v, , ii, v, v, v. I. . V. i, . V. v, i, . I.V. V. v, i, , . V. i, , v i iii 4 Ii xi , , , I . Перевалова , Лебединский , Черных , БончОсмоловская . Детекция гипертермофильных архей рода с помощьк молекулярнобиологических методов. Москва. Тезис . V. i, , v i iii iii i ii . V. i, , v . Ii i , , x, . V. i, , v ivi iv v i i. Ii xi , i, . V. i, , v ivi iv v i i. Ii , , i, . V. i, , v i ivi i i. Ii iivi, i ii i, , , vv i. V. i, i, v i ivi i , i 2 iii, , i, i. V. i, . Ii i , , , i. Глава I. С , i, v . С v . С, для
противопоставления их с гипертермофилами соответственно, температуры развития С мы будем называть умеренные температуры. Наиболее исследованными биотопами, в которых были обнаружены термофильные микроорганизмы, являются естественные геотермальные зоны горячие наземные источники и сольфатары, мелководные морские гидротермальные системы и абиссальные выходы горячих источников, более известные как черные курильщики, а также геотермально нагреваемые высокотемпературные нефтяные резервуары , . Другой тип термальных местообитаний представлен биотопами индустриального происхождения это тлеющие отвалы каменного угля и урановой руды, горячие сливные воды различных производств vv vi, . Зоны современного вулканизма сосредоточены главным образом в пределах Тихоокеанского подвижного пояса, где основными являются Японская, КурилоКамчатская, ИндонезийскоФилиппинская вулканические провинции, а также область, расположенная вдоль Тихоокеанского побережья Америки рис. Огромное количество подводных вулканов в Тихом океане распределено в основном в пределах ВосточноТихоокеанского хребта и в районах островных дуг. В Атлантическом океане подводные вулканические горы и острова тяготеют к СрединноАтлантическому хребту в том числе Исландия, Азорские острова и др Группы действующих вулканов и соответствующие геотермальные зоны известны в Средиземноморье, Малой Азии, в районе Красного моря, вдоль Восточного побережья Центральной Африки и в Антарктиде Басков, Суриков, . Рассмотрим более подробно континентальные горячие источники, поскольку именно они являлись объектами исследования в данной работе. Рис. Зоны современного вулканизма. I i i . Горячие источники, или термы, широко распространены в областях современного и новейшего вулканизма. Однако не все термы связаны с вулканами, так как с глубиной температура увеличивается, и в районах с повышенным геотермическим градиентом циркулирующая атмосферная вода нагревается до высоких температур. Рис. Происхождение геотермальных местообитаний , .