Исследование функциональной активности рН 6 антигена Yersinia pestis с помощью наборов изогенных мутантов

• Автор: Бахтеева, Ирина Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : 17 ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. АДГЕЗИЯ КАК ЭТАП ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА.

1.2. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ПИЛЕВЫХ АДГЕЗИНОВ.

1.3. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ ИНВАЗИИ.

1.4. АНТИФАГОЦИТАРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ

ПАТОГЕНОВ

1.5. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ФАКТОРАХ ПАТОГЕННОСТИ ИЕРСИНИЙ

1.5.1. АДГЕЗИНЫ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ

1.5.2. АДГЕЗИНЫ, ИНВАЗИНЫ И АНТИФАГОЦИТАРНЫЕ ФАКТОРЫ

К I.
1.5.3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 6 АНТИГЕНА
1.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. ШТАММЫ МИКРООРГАНИЗМОВ
2.2. ПЛАЗМИДЫ, ПРАЙМЕРЫ
2.3. ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ.
2.4. КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ И ПЕРВИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК
2.6. СРЕДЫ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ.
2.7. ГЕННОИНЖЕНЕРНЫЕ МАНИПУЛЯЦИИ
2.6.1 СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК.
2.6.2 КОНСТРУИРОВАНИЕ НОКАУТНЫХ МУТАНТОВ ПО ГЕНАМ
ОПЕРОПА
2.6.3 КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ ОПЕРОНА И КОМПЛЕМЕНТАЦИЯ
6 ШТАММОВ i.
2.6.4 ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНА МЕТОДОМ ПЦР.
2.7 ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ НАСЛЕДОВАНИЯ
РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЛАЗМИД ШТАММАМИ i ПРИ РОСТЕ
НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ
2.8 МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.8.1 ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА БЕЛКОВЫХ ПРЕПАРАТОВ
2.8.2 ПОДГОТОВКА ПРОБ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕКРЕЦИИ 6
АНТИГЕНА БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ
2.9 ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
2. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ 6
АНТИГЕНА
РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ
ЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ ТЕСТ
МЕТОД ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ 6 АНТИГЕНА НА
ФОРМИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНОГО МОНОСЛОЯ
МЕТОД ОЦЕНКИ КЛЕТОЧНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ АДГЕЗИИ И ФАГОЦИТОЗА . i,
. i И Е. i.
2 ЭКСПЕРИМЕНТЫ НА ЖИВОТНЫХ.
ПОЛУЧЕНИЕ КРОЛИЧЬИХ МОНОСГ1ЕЦИФИЧЕСКИХ
АИТИСЫВОРОТОК К 6 И I АНТИГЕНАМ.
ИММУНИЗАЦИЯ МЫШЕЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ПРОТЕКТИВНОСТИ 6 АНТИГЕНА
АНИМАЛИЗАЦИЯ ИСХОДНЫХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ
ШТАММОВ i
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ НАСЛЕДОВАНИЯ ПЛАЗМИД РЕКОМБИНАНТНЫМИ ШТАММАМИ . i I VIV
ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ОБСЕМЕНЕННОСТИ ОРГАНОВ
ЗАРАЖЕНИЕ ЖИВОТНЫХ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММОВ i И i.
2 МЕТОДЫ СТАТИСТИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ РЕЗУЛЬТАТОВ
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 3. АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ АДГЕЗИ1ЮВ ИЗ
ШТАММА . i 1 И КОНСТРУИРОВАНИЕ МУТАНТОВ.
3.1 СЕКВЕНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ОПЕРОН,ПОДОБНЫХ
ГЕНОВ И ГЕНОВ ПИЛЕВЫХ АДГЕЗИНОВ ШТАММА . i
3.2. ПОЛУЧЕНИЕ НОКАУТНЫХ МУТАНТОВ i И
i
3.3. ОЦЕНКА ПРОДУКЦИИ 6 АНТИГЕНА ИСХОДНЫМИ И
МУТАНТ 1ЫМИ ШТАММАМИ . i.
3.4. ОБСУЖДЕНИЕ.
ГЛАВА 4. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ 6 АНТИГЕНА НА АДГЕЗИЮ И ФАГОЦИТОЗ II
4.1. ГЕМАТЛЮТИНИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ 6 АНТИГЕГI
4.2. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ 6 АНТИГЕНА НА АДГЕЗИЮ
БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК
4.2.1. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ 6 АНТИГЕНА НА СПОСОБНОСТЬ
ii . К АДГЕЗИИ К МЫШИНЫМ МАКРОФАГОПОДОБНЫМ КЛЕТКАМ 4.1 А
4.2.2. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ 6 АНТИГЕНА НА СПОСОБНОСТЬ
ii . К АДГЕЗИИ К ЭПИТЕЛИАЛЬНЫМ КЛЕТКАМ НЕР2.
4.3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ 6 АНТИГЕНА НА ФАГОЦИТОЗ
МЫШИНЫМИ МАКРОФАГАМИ 4.
4.4. ОБСУЖДЕНИЕ.
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ, АДГЕЗИВНОЙ И МИТОГЕННОЙ
АКТИВНОСТЕЙ ПРЕПАРАТОВ 6 АНТИГЕНА
5.1 ХАРАКТЕРИСТИКА ЧИС ТОТЫ ПРЕПАРАТОВ 6 АН ТИГЕНА
i
5.2 ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ТРУБЫХ 4 КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТР АКТОВ ИЗ ИЗОГЕННЫХ И
ШТАММОВ i
5.3 ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ОЧИЩЕННОГО 6
АНТИГЕНА .
5.4 ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ 6 АНТИГЕНА НА АДГЕЗИЮ КЛЕТОК
МЛЕКОПИТАЮЩИХ.
5.5 ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ 6 АНТИГЕНА НА ДИФФЕРЕИЦИРОВКУ
КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ.
5.6 ИЗУЧЕНИЕ МИТОГЕННЫХ СВОЙСТВ 6 АНТИГЕНА.
5.8. ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ 6 АНТИГЕНА В
ЭКСПЕРИМЕНТАХ I VIV.
6.1. ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ НАСЛЕДОВАНИЯ ПЛАЗМИД 8 И I4 В ШТАММАХ . i В ОРГАНИЗМЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
6.2. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ 6 АНТИГЕНА НА ДИССИМИНАЦИЮ
У. рев В ОРГАНАХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
6.3. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ПРОДУКЦИИ 6 АНТИГЕНА НА
ВИРУЛЕНТНОСТЬ ШТАММОВ У. Р5еи1о1иЬегсиШз.
6.4. ЩНКА ВЛИЯНИЯ СПОСОБНОСТИ К ПРОДУКЦИИ 6
АНТИГЕНА НА ВИРУЛЕНТНОСТЬ ШТАММОВ У. реИ
6.5. ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ 6
АНТИГЕНА
6.6. ОЬСУЖДГЛ1ИЕ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Исследования функциональной активности продемонстрировали, что он обладает целым рядом биологических свойств, каждое из которых может обеспечивать его вклад в вирулентность чумного микроба. Вепi, и альвеолярным Степаншина с соавт. Водопьянов с соавг. Однако в экспериментах с мутантным по собственным пилевым белкам штаммом i клонированные гены У. Публиковались данные об адгезивной активности . Водопьянов, Мишанькин, i . Кроме того, при развитии псевдотуберкулезной инфекции выполняет функцию адгезина, способствуя связыванию клеток iii с мембраной эпителиальных клеток . I, . Однако позже были опубликованы данные об отсутствии влияния на способность i связываться с мембраной макрофагов . В то же время рН6 антиген обладает аитифагоцитарной активностью и препятствует захвату клеток чумного микроба макрофагами , i , . Таким образом, несмотря на всестороннее изучение функциональной активности , до настоящего времени нет единого мнения о том, какое из его свойств является определяющим вклад этого фактора в вирулентность . Анализ опубликованных работ показал противоречивость данных о цитотоксической активности и влиянии рН6 антигена на вирулентность . Адгезивные свойства установлены для i, но не для . До настоящего времени не изучены механизмы отсутствия протективной активности . В связи с вышеизложенным для уточнения роли 6 антигена в иммунопатогенезе чумы сохраняется актуальность изучения цитотоксических, митогенных и адгезивных свойств белка , а также определение его вклада в вирулентность чумного микроба. Цель исследования чюлучениейоЬьданных о функциональной активности 6 антигена и егошишдрГрулентность возбудителя чумы. Создать на основе штаммов ii . Оценить цитотоксические, митогенные и адгезивные свойства белка
4. Изучить протективные свойства и его вклад в вирулентность ii в экспериментах i viv. Научная новизна. Доказано, что не обладает цитотоксичностыо. Установлено, что не относится к обязательным факторам патогенности У. Показано, что обеспечивает адгезию возбудителя чумы к эпителиальным клеткам. Выявлена митогенная активность , а также его влияние на адгезию и дифференцировку макрофагов. Получены штаммы i со способностью к независимому от и температуры среды конститутивному синтезу 6 антигена и с их помощью проверена и опровергнута гипотеза о том, что отсутствие протективных свойств определяется особенностями рНрегуляции его синтеза. Выявлено, что 1 клетки i в организме теплокровного хозяина имеют селективные преимущества перед бактериями. Практическая значимость. Полученные данные о селективных преимуществах клеток . В коллекции живых культур ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии депонированы пять авторских штаммов . У. i в патогенезе чумы. Депонированы в нуклеотидные последовательности четырех генов, кодирующих белки У. ТНР1, стимулированной очищенным препаратом 6 антигена Оболенск, . Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Путинского государственного университета. У. рюИз не обладает цитотоксической активностью в отношении различных типов эукариотических клеток. У. ревНБ. Утрата способности к его продукции не приводит к снижению вирулентности возбудителя чумы, но его присутствие дает селективные преимущества РзаА бактериям в организме теплокровного хозяина на ранних стадиях инфекции. Большинство присущих белку РБаЛ биологических эффектов определяется именно его адгезивной активностью. В зависимости от концентрации РэаА либо стимулирует дифференцировку и адгезию макрофагов, либо вызывает их аутоагглютинацию. Отсутствие протективности 6 антигена не связано с его синтезом внутри фаголизосом и некротических очагов и недоступностью для антител и иммунокомпетентных клеток. Отсутствие протективности РбдА в совокупности с феноменом селекции РзаА бактерий в организме теплокровного хозяина объясняют факт выделения в природных очагах чумы только РбдА штаммов У реяНя, что позволяет рассматривать РяаА или кодирующие его гены как перспективную мишень для лабораторной диагностики.