Иммуномагнитная сепарация с последующей АТФ-метрией в экспресс-индикации шигелл Зонне

• Автор: Латкин, Александр Тимофеевич
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : 4 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

I. ВВЕДЕНИЕ

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ ЭПИДЕМИОЛОГИИ ШИГЕЛЛЕЗОВ

ГЛАВА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ БАКТЕРИЙ В ОБРАЗЦАХ С ПОМОЩЬЮ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТФ ГЛАВА 3. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ КАК МЕТОД ГЕН ОИНДИКАЦИ И ПАТОГЕННЫХ

МИКРООРГАНИЗМОВ

III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 2. ИММУНОМАГНИТНАЯ СЕПАРАЦИЯ ШИГЕЛЛ

ГЛАВА 3. ЭФФЕКТ СПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАНИЯ ИМБС 8.КХЕ1, ОПРЕДЕЛЯЕМЫЙ С ПОМОЩЬЮ АТФМЕТРИИ И ПОДСЧЕТОМ КОЕМЛ
ГЛАВА 4. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ СОРБЦИИ ИМБС КЛЕТОК 8.ШЕ ФАЗЫ С ПОМОЩЬЮ ПЦР
IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
V. ВЫВОДЫ
VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
АТФ аденозинтрифосфат
ТХУ трихлоруксусная кислота
дмсо диметилсульфоксид
КОЕ колониеобразующая единица
ИМБС иммуномагнитный биосорбент
п. н. пар нуклеотидов
i i относительные люминесцентные единицы
ПЦР полимеразная цепная реакция
Г1ЛВ поверхностноактивные вещества
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
термолабильный энтеротоксин
ЦТАБ цетилтриметиламмоний бромида
термостабильный энтсротоксин
I Ivi i i
x1 ii xi
x2 ii xi
мд Мега Дальтоны
I. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


При этом возбудители могут присутствовать в отобранных пробах в низких концентрациях, что требует проведения предварительного концентрирования патогенных микроорганизмов в исследуемых образцах с отделением их от сопутствующей микрофлоры. Для этого могут быть использованы различные сорбенты, в том числе иммуномагнитные сорбенты, используемые при выделении и идентификации различных патогенных микроорганизмов и их специфических антигенов ,. Магнитные свойства носителей таких сорбентов делают их управляемыми в магнитном поле, что обеспечивает возможность автоматизации процесса при работе с ними. Выступая в качестве твердой фазы, иммуномагнитные сорбенты нашли применение в комплексе с иммунофлюоресцентным, биолюминесцентным и амплификационным методами индикации ряда возбудителей ,,7. Традиционные микробиологические методы микроскопия мазков и культуральное исследование даже центрифугированных образцов малоэффективны. Экспрессные системы культивирования, в которых используются жидкие питательные среды с радиометрической или флуоресцентной регистрацией результатов, позволяют определить рост бактерий, как правило, в течение 2х дней. АТФметрия, в основе которого лежит взаимодействие АТФ, люциферазы и люциферина, сопровождающееся выделением энергии в виде излучения фотона. При этом время анализа значительно сокращается по сравнению с рутинными методами, а высокая его чувствительность позволяет определить 0 микробных клеток в 1 мл образца ,,7. Однако биолюминесцентный метод АТФмстрии неспецифичен, так как и соматические клетки макроорганизма и микробные клетки сапрофитов и патогенов содержат АТФ. В связи с указанным, актуальной является разработка экспрессметода индикации возбудителя после специфической иммуносорбции микробных клеток. I фазы на основе биолюминесцентной АТФметрии после предварительной иммуномагнитной сепарации для идентификации возбудителя в исследуемом материале. Разработать эффективный иммуномагнитный биосорбент ИМБС, пригодный для иммобилизации сывороточных углобулинов против микробных клеток Б. I фазы. Отработать методику иммуномагнитной сепарации 5. Применить сочетанный способ иммуномагнитной сепарации с последующей индикацией микробных клеток Э. БОппе I фазы путем измерения количества бактериального аденозинтрифосфата АТФметрии. Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показана принципиальная возможность использования ферромагнитных носителей, состоящих на из железа, оксида кремния и 5 оксида титана, для иммобилизации на композитных частицах углобулинов к 8. I фазы. Примененная методика металлохелатного связывания белков сохраняет специфическую активность углобулинов, обеспечивая их прочную фиксацию. Разработана технология обнаружения З. I фазы после . АТФметрии. Специфичность связывания биосорбентом клеток Б. ПЦР с праймерами, выявляющими последовательности плазмидного 1раН гена шигелл, контролирующего инвазию возбудителя. Иммуномагнитная сепарация в сочетании с биолюминесцентной АТФметрией позволяет обнаружить жизнеспособные микробные клетки в образце, содержащем 0 бактериальных тел в 1 мл, в то время как с помощью ПЦР выявляется ДНК как живых, так и нежизнеспособных клеток возбудителя. Комплексный подход, основанный на йммуносорбции 8. I фазы с последующим проведением АТФметрии, позволяет увеличить производительность диагностического лабораторного анализа за счет сокращения времени его проведения. Апробация работы материалы диссертации были представлены на Московском обществе Эпидемиологов, Микробиологов и Паразитологов февраля, , XII Международной конференции Новые технологии в биологии и медицине Гурзуф, , 5ой Всероссийской научнопрактической конференции Генодиагностика инфекционных болезней Москва, октября . Апробация диссертации состоялась на конференции отдела генетики и молекулярной биологии бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН марта г. Объем и структура работы. Работа изложена на 6 страницах, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего отечественных и 1 зарубежных авторов. Содержит рисунков и таблиц.