Изучение G белка в клинических изолятах стрептококков групп C и G и его использование в биотехнологии

• Автор: Волчек, Наталья Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 128 с. : ил.

1. Обзор литературы

1.1. Общие сведения о стрептококках и их классификация

1.2. Взаимодействие стрептококков с сывороточными белками человека

1.3. Бактериальные Бс рецепторы, реагирующие с человека и млекопитающих

1.3.1. Стафилококковый белок А

1.3.2. Стрептококковые Бс ре юпторы

1.3.3. Стрептококковый белок О , .

1.4. Взаимодействие стрептококков 1рулп А, С и О с а2М

. Характеристика плазменных белков, взаимодействующих с С белком

1.5.1. Иммуноглобулин в I структура и функции

1.5.2. Человеческий сывороточный альбумин ЧСА структура и функции

1.5.3. а2 макрог лобулин структура и функции
1 6. Использование рецепторных белков стрептококка
1 7. Применение новейших хроматографических технологий для получения белковых
препаратов
Заключение
2. Материалы и методы
2.1. Бактерии, фаги и плазмиды
2.2. Культуральные среды и условия роста
2.3. Выделение плазмидной Д1I из .i
2.4. Выделение хромосомной ДНК
2.5. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.6. Электрофорез ДК
2.7. Элюиия ДНК фрагментов из агарозных г елей
2.8. Рестрикция и лигирование ДНК
2.9. Трансформация .i
2 Получение стрептококковых экстрактов
. Ультразвуковая дезинтеграция стрептококков
. Экстракция мутанолизином
. Экстракция
. Кисло I ная экстракция
. Щелочная экстракция
2 Гибризационный анализ ДНК
2. Методы лизиса клегок .i для выделения рекомбинантных белков
2. Определение динамики синтеза I связывающих рецепторных белков
2. Выделение и очистка рекомбинантных белков
2 Электрофорез белков
2 Электроперенос белков из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозу
2 Метод колоний блотт
2. Метод коньюгирования иероксидазы хрена с белками
2. Определение белка
2. Определение способности рецептора связывать человеческий I и ЧСА
2 Определение молекулярной массы рецепторных белков
2 Получение из сыворотки крови
2 Проверка чистоты полученного препарата
2 Проверка аффинных колонок
2 Приготовление СШ дисков и трубок, коньюгированных с О белком
2 Хроматография на ОМ дисках и т рубках 2. Определение способности стрептококковых экстрактов в белка стрептококков
групп С и в связывать а2М
5 Результаты собственных исследований
3.1. Связывание О белка с а2 макроглобулином
3.1.1. Связывание белков плазмы со стрептококками группы б
3.1.2. Определение области связываня О белком с а2 макроглобулином
3.1.2.1. Выделение и очистка рекомбинантных белков ЗС, 5в и
3.1.2.2. Аффиннфя хроматография на О белок сефарозе 4В
3.2. Анализ размера и количества О белка, экспрессируемою клиническими изо л ягам и стрептококков групп С и О
3.3. Количественное определение фв и альбумин связывающей активност и О
белка в экстрактах различных штаммов стрептококков групп С и О
3.4. Анализ гена И белка изолятов стрептококков групп С и в методом ДНК ДНК гибридизации
3.5. Анализ связывающего фрагмента гена О белка стрептококков групп Сиб
методом ПЦР
3.6. Анализ ЧСА связывающего фрагмента гена С белка изолягов стрептококков
групп С и методом ПЦР
3.7. Клонирование фрагмента гена белка стрептококков групп С С и i 8,
2, отвечающею за I связывание
3.8. Клонирование фрагмента юна белка, кодирующего одни I связывающий
3.9. равнение I связывающей активности рекомбинантных белков
3 Использование I связывающего рецепторного белка в качестве лиганда в аффинной хроматог рафии для получения чистых препаратов I
3 Получение I методом аффинной хроматографии на мембранах
3 Характеристика препаратов I методами , и иммуноэлектрофореза
4. Обсуждение результатов
5. Выводы
6. Список литературы
7. Благодарности
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а2М а.2 макроглобулин
а2МТ а2 макроглобулин в комплексе с трипсином
а2ММ а2 макроглобулин в комплексе с метиламином
I иммуноглобулин А
I иммуноглобулин М
I иммуноглобулин
i ген М белка
I поверхностный белок .i поверхностный белок .i поверхностный белок .ii т.н.п. тысячи нуклеотидных пар кД тысячи дальтон
ТрисНС1 гидроксиметиламинометан солянокислый ТЕ мМ ТрисII буфер, 8.0, 1 мМ ЭДТА ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота С1М vi Ii i додецил сульфат натрия
электрофорез белков в полиакриламидном геле
забуференный физиологический раствор
I иммуноферментный анализ
блотто буфер на основе обезжиренного молока
ВШ, ТНВ i Ii, i , коммерческие жидкие
среды для приготовления культур стрешококков ЕВ i i бульон для выращивания штаммов ii i
питательные
Ар ген устойчивости к ампициллину I ген галактизидазы .i
и структурные части молекулы иммуноглобулина
рецепторный белок стрептококка, способный связывать часть молекулы
иммуноглобулина
ЧСЛ человеческий сывороточный альбумин
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ЛОВЭЖХ лигандобменная высокоэффективная жидкостная хроматография
ВВЕДЕНИЕ


Патологии респираторного тракта, кожные заболевания, постинфекционные осложнения ревматический миокардит, поел стрептококковый гломерулонефрит, такие опасные состояния как генерализованный септический и токсический синдромы, патология беременности и новорожденных вот далеко неполный перечень заболеваний, связанных со стрептококками. В последнее время участились случаи заболеваний, вызванные условно патогенными стрептококками и патогенами животных. Эти микроорганизмы, а к ним относятся и стрептококки серологических групп С и О, вызывают такие серьезные системные заболевания как тонзиллиты, импетиго, септицемия, эндокардиты, септические артриты, целлюлиты. Присоединение стрептококковой инфекции часто осложняет течение бронхолегочных заболеваний вирусной этиологии. Таким образом, лечение и профилактика стрептококковых заболеваний имеют не только медицинское, но и важное социально экономическое значение для всех стран мира Совершенствование подходов для их диагностики, профилактики и терапии становится возможным только на основе современных знаний о природе возбудителя, механизмов ею воздействия на организм человека, а также при наличии новых высоко чувствительных и специфичных средств диагностики, в том числе и экспрессных. В связи с тем, что поверхностные рецепторные белки патогенных стрептококков способны подавлять фагоцитоз, индуцировать синтез анти иммуноглобулинов, преодолевать иммунные механизмы защиты, маскируя микроорганизм под белки хозяина, многие исследователи рассматривают их в качестве факторов вирулентности. Патогенез стрептококковых инфекций обусловлен взаимодействием биологических систем организма хозяина и микроба. К числу биологически активных веществ патогенных стрептококков в первую очередь следует отнести многие вещества белковой природы, секретируемые микробной клеткой или входящие в состав ее клеточной стенки. Хорошо известно, что вирулентность стрептококков групп А, С и б коррелирует с их способностью продуцировать на поверхности клетки ряд белков. Недавно охарактеризованы гены М и М подобных белков стрептококков групп Л, С и О, которые кодируют поверхностные рецепторы, способные реагировать с Кс частью иммуноглобулинов С и А в сочетании со связыванием других сывороточных белков хозяина. Эти Бс рецепторные белки относятся к семейству М подобных белков и рассматриваются в качестве основных факторов патогенности. Большинство штаммов стрептококков групп С и О экспрессируют на своей поверхности Рс рецепторный белок, так называемый белок в. Он связывает все подклассы человеческою 1Ст, многих видов млекопитающих, человеческий сывороточный альбумин ЧСА и а2макроглобулин. Изучение О белка выявило в нем наличие повторяющихся как альбумин, так и 0 связывающих доменов. О белка. Способность в белка связывать с высокой аффинностью ЧСА и ЫО может обеспечить бактериям дополнительную защиту в организме хозяина и, в частности, защиту от воздействий иммунной системы. Благодаря способности О белка связывать участок в. С и О. Существующая классификация стрептококков основана исключительно на их антигенных различиях, в частности, на свойствах группоспецифического полисахаридного антигена или типоспецифического поверхностного белка. Генетический же анализ может явиться дополнением к идентификации штаммов групп С и О по наличию и типу гена О белка. Кроме того, не исключено, что для оценки вклада О белка в патогенность этих стрептококков, следует определять не только форму белка, но и уровень его экспрессии. Интересным, с точки зрения формирования вирулентного фенотипа стрептококков групп С и С, является тот факт, что О белок связывает а2макроглобулин, основной ингибитор протеиназ, в том числе и экзогенных. Однако область связывания а2макроглобулина белком О не определена. Имея в руках рекомбинантный белок О, кодируемый полноразмерным геном, а также рекомбинантные белки либо с связывающей функцией, либо альбумин связывающей активностью, можно попытаться определить область связывания а2макроглобулина. В дальнейшем, можно будет получить рекомбинантный рецептор к самому а2макроглобулину в чистом виде. Применение такого рецептора в качестве лиганда в аффинной хроматографии в свою очередь создаст условия для получения чистого препарата а2 макроглобулина из донорской плазмы.