Гидролазы Bacillus intermedius : Выделение, свойства, локализация

• Автор: Шарипова, Маргарита Рашидовна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 223 с. : ил.

Содержание

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Гидролитические ферменты бацилл.

1. Гуанилспецнфичные рибонуклеазы. КФ 3.1.4..

2. Щелочные фосфатазы. КФ 3.1.3..

3. Сериповые протеиназы. КФ 3.4..

II. Особенности белковою синтеза, секреции и спорообразования

у бацилл.

1. Секреция. Общие сведения

1.1. Сигнальные пептиды
1.2. Липопротеиновые сигнальные пептиды
1.3. Пропонтиды
1.4. Роль зрелой последовательности в секреции.
2. Компоненты аппарата секреции
2.1. Сигналузнающая частица.
2.2. Транслокация
2.3. Процессинг
2.4. Роль белка в секреции.
2.5. Роль РгеА белка в секреции
3. Освобождение белков в среду у бацилл. Роль клеточной стенки.
4. Синтез секретирусмых белков, связь с общим метаболизмом
и спорообразованием у бацилл
5. Роль полиаденилирования мРНК у бацилл.
Заключение.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
I. Выделение и характеристика внеклеточных гидролаз
1.1. Отбор штаммов .ii с высоким уровнем активности гидролаз и изучение оптимальных условий для продукции ферментов.
1.2. Выделение и характеристика секретнруемой щелочной фосфатазы
1.3. Выделение и характеристика секретируемой протенназы
II. Изучение клеточного топогенеза секретируемых гидролаз .ii
2.1. Внеклеточные гидролазы В. ii их соотношение
в клеточных фракциях и культуральной жидкости
2.2. Влияние условий культивирования на локализацию РНКазы
2.3. Влияние мутаций в структуре РНКазы на локализацию и
секрецию фермента
2.4. Влияние условий культивирования на локализацию
щелочной фосфатазы.
2.5. Влияние условий культивирования на локализацию протеиназы
III. Изучение физиологической функции гидролаз В. ii
3.1. Синтез гидролаз и спорообразование у В. ii
3.2. Получение мРНК из клеток В. ii и ее изучение
3.3. Взаимосвязь синтеза мРНК и синтеза гидролитических
ферментов Я ii
3.4. Изучение продуктов трансляции бактериальной полиАРНК
ОБСУЖДН1 1ИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
1. Сравнительная характеристика структуры, каталитических и физикохимических свойств исследуемых гидролаз В. ii
2. Особенности локализации и секреции гидролитических
ферментов В. ii
3. Физиологическая роль секретируемых гидролитических ферментов
В. ii.
Заключение.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Фосфатазы и с молекулярной массой . Да состояли из 0 и 9 аминокислот соответственно. В составе обоих белков превалировал лизин моль. Тем не менее, фосфатаза была более положительно заряженной в силу более высокого содержания аргинина и более низкого аспарагиновой и глутаминовой кислоты. Особенностью состава аминокислот являлось отсутствие цистеиновых остатков у этих фосфатаз. На основании кристаллической структуры фосфатазы К. i , , был проведен сравнительный анализ структуры фосфатаз бацилл, дрожжей и человека, которые показали ю гомологию . Важные для каталитической активности сайты связывания металлов, фосфатсвязывания являлись высоко консервативными для этих фосфатаз. Среди фосфатаз бацилл особый интерес представляют фосфатазы В. i . Эти бактерии имеют мультигенное семейство фосфатаз, аналогично В. . В присутствии Со2 В. продуцирует в среду в раз больше фосфатазы, чем другие бациллы, фермента эффективно секретируется в культуральную жидкость . Установлено, что молекула фосфатазы содержит Со3, который способен эффективно реактивировать апофермент. Тем не менее, фосфатаза В. Да, чем другие бактериальные фосфатазы кДа, и размеры е близки к размерам эукариотических фосфатаз. Эти данные могут указывать на путь эволюции бактериальных фосфатаз i . Секвеннрование гена щелочной фосфатазы В. фосфатаза показало, что он кодирует белок из 3 аминокислот с молекулярной массой кДа i . Последовательность обнаружила идентичности с фосфатазами и В. Сконцевая последовательность фосфатазы 1 увеличивала размеры молекулы фермента по сравнению с другими прокариотическими фосфатазами, не обнаруживала никакой гомологии с Сконцевыми участками эукариотических фосфатаз. Его функция пока не ясна. Предполагается, тем не менее, что Сконец может быть вовлечен в активацию белка. Сравнение аминокислотного состава этого фермента i . В. iii показало наибольшее сходство с мембраносвязанной фосфатазой, очищенной путем экстракции 1 М с клеточной мембраны. Аминокислотный анализ других изоферментов В. . Исходя из последовательности ДНК, соответствующая ей фосфатаза I содержит такое же количество пролина. В последовательности белка отсутствовали остатки цистсина, аналогично другим фосфатазам бацилл. концевая последовательность была более гидрофильна. . Различия домсна по размерам и последовательности могут отвечать за определенные свойства, например, белокбелковое взаимодействие. Показано, что поверхностная петля, соответствующая домену, определяла общую стабильность и конформацию изоферментов щелочной фосфатазы у млекопитающих i . Другим ферментом, представляющим интерес среди класса фосфатаз бацилл, является фосфатаза В. , ,. Особенностью этого фермента является присутствие фосфомоноэстеразной ФМЭ и фосфодиэстеразной ФДЭ активности. Авторы выделили белок ВС6 из фракции мембран клеток В. ВС6 мембраносвязанная фосфатаза. Второй белок, 1, был изолирован из культуральной жидкости мутанта В. ВС6, 1, который, в отличие от исходного штамма секретировал фосфатазу в среду. Обе фосфатазы, ВС6 и 1, обладали ФМЭ и ФДЭ активностями, которые были максимальны при 9. , а. Молекулярная масса ВС6 и 1 составляла кДа и каждый из ферментов состоял из единственной полипептидной цепи. Соотношение двух активностей на этапах очистки было постоянным. Обе активности полностью ингибировались Фн и арсеналом, активировались ионами Са2. Диапазон стабильности 6. ЭДТА, условия хранения фермента одинаковы для ФМЭ и ФДЭ. Авторы заключили, что белок обладает двумя активностями и имеет в структуре один или разные активные центры , а. Антитела к I давали реакцию в отношении ВС6, подтверждая, что белки идентичны , 6. Точечная мутация в локусе приводила к одновременной потере ФМЭ и ФДЭ активностей.