Высокомолекулярные рибонуклеазы спорообразующих бактерий

• Автор: Харитонова, Майя Александровна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 173 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основные группы рибонуклеаз.

1.1. Циклизующие 2 ,3 рибонуклеазы.

1.1.1. Низкомолекуляные гуанилспецифичные рибонуклеазы спорообразующих бактерий

1.1.2. Молекулярные механизмы каталитического действия циклизующих рибонуклеаз

1.2. Рибонуклеазы, образующие продукты с 5терминальным фосфатом

1.2.1. Рибонуклеазы эукариот

1.2.2. Внутриклеточные рибонуклеазы бактерий.

1.2.3. Высокомолекулярные 2 активируемые рибонуклеазы спорообразующих бактерий

2. Механизмы регуляции синтеза ферментов спорообразующих бактерий

2.1. Двухкомпонентные регуляторные системы бактерий
2.1.1. Двух компонентная регуляторная система трансдукции сигнала .
2.1.2. Двухкомпонентная регуляторная система трансдукции сигнала
2.2. Регуляция экспрессии генов i ii альтернативными афакторами РНКполимеразы
2.3. Закономерности синтеза гуанилепецифичных рибонуклеаз бацилл Заключение
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы и методы исследований
Результаты исследований .
1. Анализ генов i и , кодирующих биназу II и РНКазу
1.1. Сравнительный анализ генов и первичной структуры высокомолекулярных РНКаз В. ii и В.ii .
1.2. Анализ промоторов генов ЫгВ и
1.3. Анализ фрагментов геномов .ii и .ii, содержащих гены ЫгВ и
2. Скрининг представителей рода i на наличие в геноме нуклеотидных последовательностей, гомологичных генам
Ф высокомолекулярных секретируемых рибонуклеаз .ii и
.ii
2.1. Поиск последовательностей, гомологичных генам высокомолекулярных секретируемых рибонуклеаз бацилл с использованием базы данных международного банка генов.
2.2. Дотблот гибридизация ДНК представителей рода i и гена высокомолекулярной секретируемой рибонуклеазы биназы II.
3. Физиологобиохимическис механизмы регуляции синтеза высокомолекулярных рибонуклеаз .ii и .ii.
3.1. Получение рекомбинантных штаммов .ii 8, несущих плазмиду 4 с геном РНКазы .ii.
3.2. Влияние экзогенного фосфата на синтез РНКаз .ii и биназы II из .ii
3.3. Подбор оптимальной питательной среды для синтеза РНКазы .ii и исследование динамики образования фермента в процессе роста бактерий
3.4. Подбор оптимальной питательной среды для синтеза биназы II рекомбинантными штаммами .ii и исследование динамики образования фермента в процессе роста бактерий
3.5. Влияние Фн и хлорамфеникола на синтез биназы II и РНКазы .
3.6. Влияние актиномицина Д на синтез РНКаз рекомбинантными
Ш штаммами .ii 8 4 и .ii .
4. Роль двухкомпонентной регуляторной системы трансдукции
сигнала и альтернативного а фактора РНКполимеразы в регуляции экспрессии генов высокомолекулярных секретируемых РНКаз бацилл.

4.1. Выяснение роли двухкомпонентной системы трансдукции сигнала в регуляции экспрессии генов РНКаз мутантными
штаммами
4.2. Синтез РНКазы Вэп в мутантном по аЕ гену штамме В.быЬНШ 8ес
5. Выделение биназы II из культуральной жидкости
0 рекомбинантных штаммов ВлиЫШь.
5.1. Выбор оптимальных условий очистки фермента.
5.1.1. Теоретический анализ первичной структуры и свойств белка
5.1.2. Влияние значений культуральной жидкости на рибонуклеазную активность штамма В.БиЫШэ ,
. трансформированного плазмидой р1Р
5.1.3. Концентрирования фермента из культуральной жидкости
5 Скрининг сорбентов и подбор условий сорбции и десорбции биназы П.
5.2. Хроматографическая очистка биназы II из культуральной жидкости В.зиЬНШ , несущей плазмиду р1Р.
5.3. Физикохимические и каталитические свойства очищенной
биназы II.
5.3.1. Определение степени чистоты и молекулярной массы фермента
5.3.2. Спектральный анализ фермента .
5.3.3. Проверка интерферирующих активностей.
5.3.4. Определение оптимума действия биназы II
5.3.5. Влияние ионов М2 на активность биназы II.
5.3.6. Определение скорости превращения синтетических субстратов
и бимолекулярной константы скорости.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


Барназа близкий природный гомолог биназы. Выделение барназы из культуральной жидкости . КМцеллюлозе. Рехроматография на КМцеллюлозе позволяла увеличить выход выход РНКазы до
, . Было показано, что для более легкого препаративного выделения РНКаза . Кроме того, барназа была выделена из рекомбинантных штаммов . МТ5, с помощью которой ген барназы щ был проклонирован вместе с геном внутриклеточного ингибитора барстара. Барназу выделяли по методике, которая использовалась в качестве промышленной технологии для получения РНКазы . Балабан и др. Барназа белок, состоящий из 0 аминокислотных остатков и имеющий молекулярную массу 2 , . Степень гомологии барназы и биназы по первичной структуре составляет , а число заряженных аминокислотных остатков практически совпадает дополнительный остаток у барназы. Отличающиеся аминокислоты разбросаны по всей длине молекулы и касаются в основном поверхностных остатков, а не локализованы в какойто определенной области Нуркиянова и др. Голышин и др. Рибонуклеаза . РНКаза Ври является функциональным и структурным гомологом РНКазы . Струминская и др. Деменьтьев, а. В результате выделения был получен препарат со степенью очистки 0 и выходом . Ген РНКазы Ври клонирован в . Знаменская и др. Молекулярная масса РНКазы Ври совпадает с молекулярной массой биназы I. Регуляторные области генов РНКазы Ври и биназы содержат отличающихся нуклеотидов. Деменьтьевым с соавторами выделены и охарактеризованы рибонуклеазы . Рибонуклеаза из . РНКаза по аминокислотному составу, физикохимическим и каталитическим свойствам практически идентична биназе I и отличается от нее лишь единственной аминокислотной заменой треонин в положении 6 биназы заменен на аланин в РНКазе . Именно эта единственная аминокислотная замена приводит к более низкой термостабильности РНКазы в сравнении с биназой Дементьев и др. Ген РНКазы клонирован в . РНКазы и биназы Кожаринова и др. Рибонуклеаза, выделенная из . РНКаза i по первичной структуре гомологична барназе. Различия первичных структур РНКаз i и барназы локализованы в 3х позициях лейцин в РНКазе i заменен на глутамин в барназе, аланин в РНКазе i заменен на глицин в барназе, лизин4 в РНКазе i заменен на глутамин в барназе. Дементьев и др. Существенных отличий в биохимических характеристиках ферментов не отмечено. Молекулярная масса гуанилепецифичной РНКазы . РНКаза Всо 6 . Белок состоит из 9 остатков аминокислот, по аминокислотному составу и физикохимическим свойствам абсолютно идентичен РНКазе . Дементьев и др. Голышин и др. Для выделения РНКаз , i и Всо была разработана трехстадийная схема, включающая в себя подкисление культуральной жидкости, позволяющее освободится от кислотолабильных протеаз и фосфодиэстераз, концентрирования РНКазы ступенчатой сорбцией на фосфоцеллюлозе и обращеннофазовой хроматографии с использованием препаративной колонки С. В результате очистки РНКаз , i и Всо были получены препараты со степенью очистки , 0 и 2, выход составил , и , соответственно Деменьтьев, а. При выделении и очистке гуанилспецифичной рибонуклеазы . РНКазы Вро получены три формы РНКазы Вро РНКазы , II, ВроШ. Показано, что две формы фермента РНКазы и ВроШ представляют собой проформы зрелого белка РНКазы II и содержат в концевых частях молекул дополнительные сегменты из и 6 Ф аминокислотных остатков Дементьев и др. Наиболее изученным представителем циклизующих РНКаз является бычья панкреатическая РНКаза А рибонуклеинатпиримидиннуклеотидо2трансфераза циклизирующая i . Механизм каталитического действия РНКазы А был предложен Матиасом, Рабиным и соавторами i . Реакция катализируется по механизму кислотноосновного катализа с Ф участием двух остатков гистидина i и i9. На стадии гидролиза циклофосфатов i и i9 меняются ролями i9 активирует атаку воды по механизму общего основного катализа, i является кислотным катализатором, протонирующим уходящую группу. Нуклеофильное замещение у атома фосфора в реакции этого типа протекает как реакция присоединения отщепления, в которой образуется промежуточное состояние с пентакоординированным атомом фосфора.