Биосинтез, выделение и характеристика внеклеточной сериновой протеиназы Bacillus intermedius 3-19

• Автор: Ицкович, Елена Лазаревна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 139 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основные принципы классификации протеолитических ферментов сериновые протеиназы микроорганизмов
2. Секретируемые сериновые протеиназы микроорганизмов физикохимические свойства и субстратная специфичность субтилизинов.
3.Тиолзависимые сериновые протеиназы микроорганизмов особое подсемейство субтилизинов

3.1. Отличительные признаки тиолзависимых прогеиназ.

3.2. Характеристика тиолзависимых протеиназ, выделенных из различных источников.

4. Структура и строение активного центра субтилизинов.

4.1. Первичная, вторичная и третичная структуры субтилизинов

4.2. Механизм действия и сгроение активного центра субтилизинов.
4.3. Источники стабильности субтилизинов
5. Участие субтилизинов в синтезе пептидных связей
5.1. Возможности пептидных синтезов в присутствии субтилизинов
5.2. Использование сложных эфиров в пептидных синтезах с помощью субтилизинов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
1. Оптимизация состава питательной среды и условий культивирования для получения максимальной продукции протеиназы.
1.1. Влияние неорганического фосфата и источников углерода на биосинтез протеиназы В. ii
1.2. Оптимизация состава среды для получения протеиназы.
1.3. Влияние аминокислот и субстратов протеиназы на биосинтез фермента.
1.4. Изучение динамики роста культуры, биосинтеза протеиназы и спорообразования В. ii 3.
2. Выделение и очистка протеиназы В. ii 3
2.1. Выбор оптимальных условий очистки фермента
2.2. Получение гомогенного препарата протеиназы из культуральной жидкости В.ii 3.
3. Характеристика протеиназы
3.1. Спектральная характеристика, молекулярная масса, изоэлектрическая точка и кинетические параметр протеиназы.
3.2. Оптимум действия фермента.Температурный оптимум и термостабильность протеиназы
3.3. Влияние ионов Са на тсрмостабильность ферментадаиствие ионов двухвалентных металлов на протеолитическую активность
3.4. Субстратная специфичность протеиназы В.ii 3.
3.5. Влияние ингибиторов и денатурирующих агентов на протеолитическую активность
3.6. Действие органических растворителей на активность протеиназы.
3.7. Участие протеиназы В.ii 3 в ферментативном синтезе пептидной связи
3.8. Аминокислотный состав и концевая последовательность протеиназы
В.ii 3
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЛИТЕРАТУРА


Подкласс пептидгидролаз делится на две группьппептидазы экзопептидазы,3. При этом пептидазы классифицируются по положению расщепляемой связи в пептидной цепи, а протеиназы по строению активного центра , . Данная классификация не может быть признана удовлетворительной,так как смешиваются два совершенно разных признака специфичность расщепляемой связи и структура активного центра фермента. Кроме того, существуют ферменты, обладающие как экзо, так и эндопептидазной активностью. Однако, очевидны и преимущества такой единой классификации она создает хорошую основу для рассмотрения структуры и механизма действия ферментов с единых химических позиций. В группе экзопептидаз, аминопептидазы 3. конца полипептидной цепи. Карбоксипептидазы 3. Сконца белковой цепи. По механизму действия выделяют три типа карбоксипептидаз сериновые 3. Дипептидазы 3. Дипептидилпептидазьт 3. конца и Сконца белковой цепи, соответственно. Особую группу составляют омегапептидазы 3. , так и сСконца полипептида. На основе строения активного центра выделяют 4 основные группы протеиназ. Сериновые протеиназы 3. Цистеиновые протеиназы 3. Аспартильные карбоксильные протеиназы 3. действия ниже 5 изза участия кислых групп двух аспарагиновых остатков в процессе катализа. Металлопротеиназы 3. Протеиназы этих групп различаются по их чувствительности к ингибиторам. Так, сериновые протеиназы ингибируются и цистеиновые тяжелыми металлами и йодацетамидомаспартильные протеиназы пепсгатином, и металлопротеиназы хелатирующими реагентами. Если не проведена очистка и имеется смесь протеиназ, то эти ингибиторы дают возможность определить, какие классы протеиназ присутствуют в этой смеси. Приведенная выше классификация протеиназ хорошо коррелирует с их оптимумом действия. У микроорганизмов обнаружены и описаны протеиназы всех четырех основных групп. На основании имеющихся в литературе данных можно заключить, что штаммы i секретируют металло иили сериновые протеиназы, а кислые протеиназы в основном образуют грибы и высшие эукариоты Селезнева А. А и др. Долгих М. С,Ваганова Г. И и др. . . Нужно отметить, что ферменты микроорганизмов делятся на две большие группы в соответствии с их локализацией внеклеточные секретируемые и внутриклеточные i М. Кроме того, протеиназы микроорганизмов иногда классифицируются иными способами. Например, на микробиологических производствах, на основании оптимума их действия кислые, нейтральные, щелочные на основе их способности гидролизовать специфические белки эластазы, коллагеназы, кератиназы и т. . ,. Далее мы остановимся подробнее на сериновых протеиназах микроорганизмов. Сериновые протеиназы хорошо изученный класс протеолитических ферментов,представляющий собой классический образец конвергентной эволюции ферментов двух семейств химотрипсина и субтилизина. Указанные семейства весьма обширны, они имеют одинаковый каталитический механизм, но совершенно различную пространственную структуру и свойства. Общий признак, характеризующий сериновые протеиназы, заключается в следующем все сериновые протеиназы чувствительны к специфическим ингибиторам, взаимодейсгвующим с остатком серина, входящим в активный центр фермент , и некоторым природным ингибиторам микробного и животного происхождения. Эти ингибиторы подавляют каталитическую активность ферментов, причем существуют количественные различия действия тех или иных ингибиторов на разные ферменты этой группы. Другим достаточно общим признаком для этих ферментов является то, что все они функционируют в основном в щелочной среде 9. Молекулярный вес сериновых протеиназ сильно варьирует от кДа до 00 кДа. Семейства химотрипсина и субтилизина часто неправильно называют сериновыми протеиназами млекопитающих и микроорганизмов, или эукариотическими и прокариотическими сериновыми протеиназами. Субтилизины будут подробно рассмотрены в следующей главе, а здесь кратко рассмотрим остальных представителей сериновых протеиназ.