Биосинтез внеклеточных гуанилспецифичных рибонуклеаз Bacillus thuringiensis и Bacillus circulans

• Автор: Морозова, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 141 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Регуляция экспрессии генов бацилл на уровне транскрипции

1.1. РНКполимераза и сг факторы i i i.

1.2. Структура промоторов генов i ii.

1.3. Регуляция экспрессии генов i ii

в неблагоприятных условиях внешней среды

1.3.1 .Двухкомпонентные регуляторные системы бацилл

1.3.2. Регуляция экспрессии генов альтернативным

фактором

2. Гуаниспецифичные рибонуклеазы бацилл

2.1. Физикохимические свойства белков
2.2. Клонирование генов рибонуклеаз.
2.3. Биосинтез рибонуклеаз
Заключение
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы и методы исследования.
Результаты исследований.
1. Биосинтез гуанилепецифичных РНКаз i iii
и i i
1.1. Подбор оптимальной питательной среды для биосинтеза РНКазы В. iii и исследование динамики образования фермента в процессе роста бактерий
1.2. Влияние экзогенного фосфата на биосинтез РНКазы
В. iii.
1.3. Подбор оптимальной питательной среды для биосинтеза РНКазы В.i и исследование динамики образования фермента в процессе роста бактерий.
1.4. Влияние экзогенного фосфата на биосинтез РНКазы
В. i.
2. Анализ генов гуанилепецифичных рибонуклеаз i iii и i i
2.1. Ген внеклеточной гуанилепецифичной РНКазы
В. iii.
2.2. Ген внеклеточной гаунтспецифичпой РНКазы
В.i
3. Биосинтез РНКаз i iii и i i в рекомбинантных штаммах i ii
3.1. Конструирование плазмид, содержащих полные гены РНКаз и i и обеспечивающих экспрессию этих генов
в клетках В. ii.
3.2. Динамика биосинтеза гуанилепецифичных РНКаз В. iii и В. i в рекомбинантных
штаммах В.ii, несущих плазмиды и .
3.3. Влияние неорганического фосфата
на биосинтез РНКазы и РНКазы i в рекомбинантных
штаммох В. ii.
3.4. Выяснение роли двухкомпонентной системы трансдукции сигнала в регуляции экспрессии генов РНКазы i и РНКазы с использованием
рекомбинантных штаммов В.ii.
3.5. Биосинтез РНКазы , РНКазы i и барназы
в мутантном по гену штамме В.ii
4. Влияние актиномицина Д на биосинтез бациллами гуанилспецифичных РНКаз и щелочных фосфатаз исходными штаммамипродуцентами и рекомбинантными штаммами i ii
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЛИТЕРАТУРА
Список сокращений и условных обозначений
а.о. аминокислотные остатки
I К рибонклеиновая кислота
РНКаза рибонуклеаза
Фн неорганический фосфат
ЭД ГА этилендиаминтетрауксусная кислота
ПЭГ полиэтиленгликоль
ДНТФ динукдеозидтрифосфаты
т.п.н. тысяча пар нуклеотидов
i низкофосфатная лептонная среда
i i низкофосфатная синтетическая среда
i рибонуклеаза, секретируемая В. i i
Ва рибонуклеаза, секретируемая .ii
рибонуклеаза, секретируемая .iii
Вс рибонуклеаза, секретируемая В.i
Всо рибонуклеаза, секретируемая В.
Вро рибонуклеаза, секретируемая В.роутуха
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Регуляция экспрессии генов бактерий сложный многоступенчатый процесс, который осуществляется как на уровне транскрипции и трансляции, так и на более поздних этапах секреции экзобелков, процессинга готового белка, фолдинга и т. Однако началом всего регуляторного процесса является инициация синтеза матричной РНК, чему будет посвящена часть обзора литературы. РНКполимераза и а факторы i ii Транскрипцию у бактерий ведет общий для всех генов фермент РНКполимераза. Сам процесс транскрипции осуществляется в три стадии инициации, элонгации и терминации i, . Па первой и последней стадиях РНКполимераза взаимодействует с ДНК, чтобы начать синтез РНК или отделяется от нее по завершении синтеза. Между этими стадиями осуществляется собственно процесс синтеза РНК. РНКполимераза, рассматриваемая ранее только как фермент, осуществляющий включение рибонуклсозидтрифосфатов в рибонуклеиновые кислоты в присутствии ДНКматрицы, сейчас рассматривается как основная часть более сложного комплекса, участвующего в транскрипции. Исходная ферментативная активность это лишь минимальный компонент того, что можно назвать РНКполимеразой. Она лишь контролирует правильное спаривание рибонуклеотидов с ДНК и катализирует образование фосфодиэфирных связей между ними. Для инициации и терминации синтеза мРНК необходимы дополнительные свойства белка. Кроме того, инициация и терминация транскрипции происходят в определенных сайтах Д1 ПС и зачастую требуют дополнительных факторов. С помощью биохимических методов в РНКполимеразе можно выдели ть два компонента минимальный фермент или корфермент и сигмафактор стфактор , v, . Молекулярная масса 3,3, сх2 Да, Да и 2 Да, соответственно i, i, . Каждая из этих субъединиц необходима для функционирования фермента i, . В составе минимального фермента . В экспериментах i vi установлено, что наличие этой субъединицы не является необходимым для проявления активности РНКполимеразы, а мутации в гене, кодирующем со субъединицу, не дают фенотипического проявления , , . При присоединении к минимальному ферменту фактора формируется полный фермент холофермент. РНКполимеразы с ДНК , , . Он нарушает способность фермента связываться со случайными участками ДНК, способность фермента узнавать специфические участки связывания за счет этого повышается примерно в 0 раз. Распознавание промоторов холоферментом существенно отличается от реакции минимального фермента со слабыми участками связывания v, . Взаимодействие холофермента с промотором начинается с формирования так называемого закрытого комплекса, который затем переходит в открытый комплекс при этом происходит плавление небольшого участка ДНК в пределах той последовательности, которая связана с ферментом. Обычно фермент экранирует примерно нуклеотидных остатков, внутри которых нуклеотидов находятся в неспаренном состоянии и образуют участок с одноцепочечной структурой. В результате такого ряда событий происходит прочное связывание РНКполимеразы с ДНК. Наиболее полно охарактеризована РНКполимераза . Описаны биохимические свойства ферментов, клонированы гены, детерминирующие субъединицы гроАау гроВф и Р, а. Несмотря на то, что большинство свойств РНКполимеразы . РНКполимеразе . Одним из отличий минимального фермента . Да. РНКполимеразы, выделенной из клеток, зараженных фагом Рего . Добавление субъединицы в транскрипционную систему i vi снижает неспсцифическую инициацию транскрипции i . Причем 5субъединица может связываться с минимальным ферментом как в отсутствии, так и в присутствии асубъединицы . Изучение структуры РНКполимеразы в условиях, способствующих и препятствующих формированию стабильных коплексов ДНКфермент, свидетельствует о том, что 6субъединица функционирует еще до инициации транскрипции и освобождается из РНКполимеразы при образовании инициирующего комплекса i, i, , тогда как а не высвобождается до тех пор, пока не начнется транскрипция. По видимому, 5 усиливает селективность промоторов за счет ограничения числа возможных взаимодействий, а не участвует в узнавании промотора , i, . Еще одним существенным отличием РНКполимеразы . А кодируется геном i. Ь i .