Выделение из штаммов Nocardia species LK, Rhodococcus species LK2 и Azospirillum brasilense UQ 1796 сайт-специфических эндонуклеаз и их характеристика

• Автор: Забазная, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино-на Оке
• Количество страниц: 145 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .

1.1. Явление модификациирестрикции.

1.2. Сайтспецифические эндонуклеазы и метилазы.

1.2.1. Распространение сайтспецифических эндонуклеаз и метилаз

1.2.2. Номенклатура сайтспецифических эндонуклеаз и метилаз

1.3. Классификация сайтспецифических эндонуклеаз рестрикции.

1.4. Ферменты типа I

1.5. Ферменты типа II.

1.6. Ферменты типа III
1.7. Ферменты типа IV.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы
2.2. Методы.
2.2.1. Получение бактериальной биомассы и лизата.
2.2.2. Определение ферментативной активности сайтспецифических эндонуклеаз
2.2.3. Определение наличия ферментативной активности сайтспецифических метилаз во фракциях
2.2.4. Определение качества препаратов сайтспецифических эндонуклеаз .
2.2.5. Определение точек расщепления ДНК сайтспецифи чески ми эндонуклеазами.
2.2.6. Определение молекулярной массы эндонуклеазы
з
2.2.7. Выделение плазмидной ДНК,репликативной и
одноцепочечной форм фага М.
ГЛАВА 3. Поиск штаммов, содержащих сайтспецифические
эндонуклеазы.
3.1. Выделение и селекция штаммов.
3.2. Определение рестриктазной активности выделенных штаммов.
3.3. Физиологобиохимическая характеристика и идентификация штаммов, содержащих рестриктазы.
ГЛАВА 4. Выделение и характеристика сайтспецифической
эндонуклеазы из i 1 i .
4.1. Выделение сайтспецифической эндонуклеазы
4.2. Определение молекулярной массы сайтспецифической эндонуклеазы .
4.3. Определение сайта узнавания и точек расщепления
4.4. Некоторые свойства рестриктазы .
ГЛАВА 5. Выделение и характеристика сайтспецифической
эндонуклеазы из i i .
5.1. Выделение сайтспецифической эндонуклеазы I
5.2. Определение сайта узнавания и точек
расщепления I.
5.3. Некоторые свойства эндонуклеазы I
ГЛАВА 6. Выделение и характеристика сайтспецифических
эндонуклеаз из i 2
6.1. Выделение сайтспецифических эндонуклеаз I и I I
6.2. Определение сайтов узнавания и точек расщепления.
6.3. Некоторые свойства рестриктаз I и I1
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРА


Второй фермент, ДНКметилтрансфераза, является модифицирующим, он узнает ту же последовательность ДНК и метилирует ее. В результате метилированная последовательность не узнается собственной рестриктазой. При попадании в клетку чужеродной ДНК эндонуклеаза рестрикции расщепляет узнаваемые последовательности чужеродной ДНК, но не собственной ДНК, защищенной с помощью модифицирующей ДНКметилазы. Таким образом, система модификациирестрикции служит для защиты клетки от заражения чужеродной ДНК 6. В конце х годов были выделены эндонуклеазы рестрикции из штаммов . К и В ,. Выделение подобного фермента из клеток i i явилось одним из факторов возникновения в начале х годов генной инженерии. Это объясняется тем, что вопервых, анализируются микроорганизмы, для которых бактериофаги не выделены, а вовторых тем, что поиски новых штаммовпродуцентов рестриктаз ведутся с практической целью найти ферменты с новой специфичностью. Отнесение вновь открытых ферментов к системе модификациирестрикции основывается на аналогии с такими хорошо изученными системами модификациирестрикции, как I, i II. Описанию свойств ферментов, отнесенных к системе модификациирестрикции, выделенных из разных микроорганизмов, и посвящен главным образом обзор литературы. Распространение сайтспецифических эндонуклеаз и метилаз. Основная масса ферментов модификациирестрикции была обнаружена в клетках микроорганизмов , хотя явления, напоминающие модификациюрестрикцию, обнаружены при изучении геномного импринтинга у мышей . Система рестрикции может также кодироваться некоторыми бактериофагами и вирусами одноклеточной водоросли . К настоящему времени проведен скрининг более ООО штаммов бактерий и примерно в четверти найдены сайтспецифические эндонуклеазы . Эти ферменты встречаются у микроорганизмов из различных таксономических групп, распространенных в различных экологических нишах. Вероятно количество штаммов, содержащих рестриктазы, значительно больше, так как присутствие рестриктазы может маскироваться сильной нуклеазной активностью в экстракте, отсутствием специфичного сайта в молекулах ДНК, используемых в качестве субстрата при скрининге, потребностью рестриктазы в необычных кофакторах или необычных условиях инкубации для выявления активности и, наконец, низким содержанием или высокой лабильностью фермента. Среди бактериальных штаммов, содержащих системы модификациирестрикции,примерно половина имеют по две или три, а иногда и более систем . Номенклатура сайтспецифических эндонуклеаз и метилаз. В настоящее время известно более сайтспецифических эндонуклеаз, которые проявляют более 0 специфичностей 1. Поскольку в одном штамме может содержаться несколько различных эндонуклеаз, возникает необходимость специальной номенклатуры для их обозначения. Правила номенклатуры были предложены Смитом и Натансоном название фермента составляется из первой буквы родового названия и двух первых букв видового названия штамма продуцента. Эти обозначения даются курсивом. Например, Есо указывает на то, что фермент выделен из ii i, Нра из i i. Следующие буквы в названии фермента используются для указания на определенный штамм. Так, в названии i II соответствует ферменту, выделенному из штамма i i серотипа . Буквенные обозначения следующие после первых трех букв могут означать также название экстрахромосомного элемента, кодирующего систему модификациирестрикции. Например, в названии буква означает, что система закодирована плазмидой, кодирующей резистентность к антибиотику. Однако она может обозначать профаг с системой модификациирестрикции . Так, в названии фермента Р1 обозначает, что система кодируется фаговым геномом Р1. Различные системы, выделенные из одного и того же штамма, обозначаются римскими цифрами. Для обозначения метилазы впереди ставится буква М с точкой, для обозначения рестриктазы . Если из контекста ясно, о каком из этих ферментов идет речь, буквы М и опускаются.