ДНК-зависимые РНК-полимеразы микоплазм

• Автор: Бабичев, Владимир Васильевич
• Шифр специальности: 03.00.07, 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Киев
• Количество страниц: 151 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. ДНКЗАВИСИШЕ РНКПОЛИМЕРАШ ПРОКАРИОТ . .

1.1. Открытие ДНКзависиюх РНКполимераз

1.2. Выделение и очистка препаратов РНКполимераз

1.3. Физикохимические и молекулярнобиологические свойства РНКполимераз прокариот .

1.3.1. Гетерогенность структуры РНКполимераз . .

1.3.2. Роль полипептидов РНКполимераз в процессе транскрипции .

1.3.3. Структурная гомология РНКполимераз прокариот и эукариот.

Г.3.4. Бактериальные РНКполимеразы, модифицированные под влиянием бактериофагов

1.3.5. Разнообразие реакций, катализируемых РНК
полимеразами.
1.4. Влияние различных факторов на активность
РНКполимераз .
ГЛАВА П. ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА ПРЕДСТАВИТЕЛЕМ КЛАССА
шцыситьв ,
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА Ш. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Объекты исследования
3.2. Культивирование микроорганизмов .
3.3. Определение активности РНКполимераз .
3.4. Получение и приготовление матриц
3.5. Выделение и очистка РНКполимераз из шкоплазм.
3.6. Электрофорез препаратов РНКполимераз
3.7. Методы изучения влияния различных факторов
на активность РНКполимераз шкоплазм ГЛАВА У. ВЫДЕЛЕНИЕ И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ДНКЗАБИСИШХ РНКПОЛИМЕРАЗ ШКОПЛАШ
4.1. Получение РНКполимеразы из возбудителя бледнозеленой карликовости зерновых . 8
4.2. Получение РНКполимеразы из сацрофитной МИКОПЛазш iii 8 . .
4.3. Получение РНКполимеразы из микоплазмы i v.i 3 патоген
ной для животных.
ГЛАВА У. СУЕЬВДИНИЧНАЯ СТРУКТУРА ДНКЗАВИСИШХ РНК
ПОЛИМЕРАЗ МИК0ПЛАЗ1
ГЛАВА У1.ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ
РНКПОЛИМЕРАЗ МИКОПЛАШ
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ .
ЛИТЕРАТУРА


Фермент способен строить из четырех НТФ РЯКполимер, комплементарный ДНКматрице. Катализируемая им реакция требует участия ионов магния или марганца и протекает с высвобождением пирофосфата. Образующийся РНКполимер содержит 3,5фосфодиэфирные мостики. РНК и таким образом строит РНК в направлении 53. Этот цроцесс назвали транскрипцией и его стали считать первым этапом экспрессии генетической информации, закодированной в ДНК, путем перевода ее в соответствующий тип иРНК i, , i, 1. Один из первых методов получения чистых препаратов РНКполимераз был предложен Чемберленом И Бергом i, , . При изучении свойств бактериальных РНКполимераз было установлено, что они осаждаются стрептомицином и протаминсульфатом i. Экстракцию ферментов проводили путем обработки клеток ультразвуком с последующим осаждением РНКполимеразы стрептомицином или протаминсульфатом. Однако использование ультразвука имело свои недостатки, поскольку сопровождалось появлением артефактов в субъединичном составе РНКполимераз, обусловленных нарушением целостности молекул фермента или отдельных его субъединиц. Наряду с этим, стрептомицин и протамянсульфат существенно снижали активность РНКполимераз. В связи с чем, ферментные препараты, полученные по методу Чемберлена и Берга, оказались непригодны для исследования их субъединичного состава и других молекулярнобиологических свойств. В дальнейшем метод был усовершенствован и предложена модификация, предусматривающая хроматографию ферментов на гидроксилапатите. Это позволило получать более чистые препараты РНКполимераз i, 6. Большая молекулярная масса РНКполимераз легла в основу разработки метода выделения с применением седиментации в градиенте концентрации сахарозы i, vi, i, а, гельфильтрации на агарозе , , . Бэбинет i, заменил переосавдение ферментов стрептомицином или протаминсульфатом на фракционирование РНКполимераз сульфатом аммония с последующей хроматографией на ДЭАЭсефадексе. Этот метод также имел недостатки длительное центрифугирование и диализ сопровождались потерями активности фермента вследствие протеолиза. Буржес , а вместо высокоскоростного центрифугирования предложил комплексный метод, основанный на последовательной обработке лизатов клеток бактерий ДНКазой, сульфатом аммония и хроматографию на ДЭАЭцеллюлозе и фосфоцеллюлозе. Им же было показано, что включение глицерина и дитиотреитола в буферные растворы повышает стабильность ферментных препаратов при выделении их из клеток бактерий. Фракционирование в условиях низкой и высокой ионной силы растворов сульфата аммония позволяло получать ферменты высокой степени очистки. Так как РНКлолимераза является белком с кислотными свойствами, то при 7,08,0 она осаждается щелочным полимером, таким как полимин Р ii . . Осавдение полимином Р или полиэтиленгликолем позволяет селективно фракционировать и концентрировать РНКполимеразы. Полиэтиленгликоль и полимин Р осаждают нуклеиновые кислоты и ассоциированные с ниш белки, в том числе и РНКполимеразы. Недостатком применения этих полимеров является их потенциальная ингибиторная активность в отношении РНКполимераз. Для того, чтобы получить ферменты с высокой активностью, полимеры удаляют цри помощи хроматографии на ДЭАЭцеллюлозе ii . , i . , i, , на ДНКагарозе i, , vi . Аффинная хроматография наиболее перспективный из всех перечисленных здесь методов выделения и очистки РНКполимераз, поскольку обеспечивает более высокую активность препаратов. Так, в случае РНКполимеразы . Буржеса , а. I.3. РНКполимераза является белкомферментом необычно большой молекулярной массы дальтон. Субъединичная структура РНКпслимераз всех изученных бактерий однотипна. В ее состав входят большие субъединицы с молекулярными массами порядка 0 дальтон. I. Холофермент имеет субъединичный состав , 6.