Использование ПЦР и секвенирования для выявления и анализа генома коронавируса крупного рогатого скота

• Автор: Кудрявцев, Владислав Александрович
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 103 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Коронавирусная диарея новорожденных телят

2.1.1. Эпизоотология.

2.1.2. Клинические признаки

2.1.3. Патогенез и патологоанатомические изменения

2.1.4. Диагностика

2.1.5. Специфическая профилактика.

2.2. Коронавирусная инфекция дыхательных путей.

2.3. Зимняя дизентерия.

2.4. Характеристика семейства Согопаугсае
2.5. Структура вириона и физикохимические свойства
коронавируса крупного рогатого скота
2.6. Геном коронавируса крупного рогатого скота
2.7. Основные структурные белки коронавируса крупного рогатого скота.
2.7.1. Нуклеокапсидный протеин
2.7.2. Интегральный мембранный протеин
2.7.3. Спайковый гликопротеин.
2.7.4. Гемагглютининэстеразный гликопротеин
2.8. Репликация коронавируса крупного рогатого скота.
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Материалы.
3.1.1 Штаммы вируса.
3.1.2. Оборудование.
3.1.3. Растворы и реактивы
3.2. Методы
3.2.1. Выделение суммарной РНК.
3.2.2. Реакция обратной транскрипции.
3.2.3. Амплификация кДНК.
3.2.4. Вариант ПЦР сопИпиош
3.2.5. Очистка продуктов ПЦР.
3.2.6. Реакция секвенирования.
3.2.7. Компьютерный анализ данных
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. .
4.1. Разработка и применение метода выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью
ПЦР и секвенирования фрагмента НЕ гена.
4.1.1. Исследование профиля вариабельности НЕ гена.
4.1.2. Выбор первичной структуры праймеров.
4.1.3. Оптимизация условий постановки ПЦР и секвенирования.
4.1.4. Апробация метода и анализ полученных данных.
4.2. Разработка и применение метода выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью
ПЦР и секвенирования вариабельной области в гена.
4.2.1. Исследование профиля вариабельности Б гена
4.2.2. Выбор праймеров, условий постановки ПЦР и секвенирования
4.2.3. Апробация метода и анализ полученных данных.
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
6. ВЫВОДЫ.
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ.
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Применение методов молекулярной биологии, таких как ПЦР и секвснирование, открывает широкие возможности для выявления и изучения инфекционных агентов. Поскольку проводимые ранее диагностические исследования показали широкое распространение КВ КРС на территории РФ, разработка методики выявления и штаммовой дифференциации вируса на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования, с последующим анализом амплифицированных нуклеотидных последовательностей генома изолятов, выявленных на территории Российской Федерации, которая прежде не изучалась, что имеет как научное, так и практическое значение. Цель и задачи исследований. Основной целью данных исследований являлась разработка методов выявления и штаммовой дифференциации коронавируса КРС, а также анализ первичной структуры изолятов, выявленных на территории РФ и штаммов изученных ранее. КРС. Научная новизна исследований. Впервые разработаны методы выявления и штаммовой дифференциации коронавируса КРС на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования амплифицированных фрагментов генома вариабельных областей гемагглютининэстеразного НЕ и спайкового Э генов. Определены оптимальные условия проведения ПЦР и секвенирования. Показана возможность применения разработанных методов для выявления коронавируса КРС в образцах патматериала от телят и взрослых животных. Впервые определена первичная структура вариабельных фрагментов НЕ и Б генов изолятов коронавируса КРС, выявленных на территории РФ. Проведен сравнительный анализ первичной структуры исследованых фрагментов генома штаммов и полевых изолятов коронавируса КРС. Нуклеотидные последовательности вариабельной области гемагглютининэстеразного гена тринадцати выявленных изолятов депонированы в СепВапк АУАУ. Практическая значимость исследований. Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором института в г. Методика выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и ссквенирования фрагмента НЕ гена и в г Методика выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования вариабельной области Б гена. Установлена первичная структура вариабельной области гемагглютининэстеразного гена 3 штаммов коронавируса крупного рогатого скота из коллекции музея ВНИИЗЖ и полевых изолятов, выявленных на территории РФ. Определена первичная структура вариабельной области спайкового гена 2 штаммов коронавируса крупного рогатого скота из коллекции музея ВНИИЗЖ и 8 полевых изолятов, выявленных на территории РФ. Данные методы применяются для выявления и штаммовой дифференциации КВ КРС в образцах различных биоматериалов как от живых, так и от павших животных. Результаты исследований учитываются при постановке диагноза. Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота ВНИИЗЖ, г. Владимир г. Актуальные проблемы болезней молодняка г. Воронеж г. Генодиагностика инфекционных заболеваний г. Москва г. Публикация результатов исследований. Результаты исследований изложеныв 6 печатных работах. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 3 страницах и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение. Список литературы включает 2 источника. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами. Автор выражает искреннюю благодарность к. Г.Н. Дороненковой, вед. М.И. Шульпину, вед. А.Е. Вечерову, м. С.А. Чупину и вег. А.М. Тиминой за помощь при выполнении отдельных этапов работы. Эпизоотология. Коронавирус крупного рогатого скота КВ КРС был впервые обнаружен в штате Небраска США группой исследователей Линкольнского университета в г. КВ КРС обнаружен во многих странах, и вероятно широко распространен во всем мире , ,, 4, 6, 7,1. Первые сообщения в России по выявлению КВ КРС были сделаны О. В. Богатыренко в году. Антитела к данному вирусу могут быть обнаружены у большинства взрослых животных , . КВ КРС выявляется как у больных от 8 до , так и у здоровых телят от 0 до , , , , , 4, 7.