Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов

• Автор: Фёдорова, Оксана Фёдоровна
• Шифр специальности: 03.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Нижний Новгород
• Количество страниц: 145 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ.

Н.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Значимость РВГЭ в инфекционной патологии детей на современном этапе.

2. Структурная и молекулярная организация ротавириона

2.1. Вирион и его структурные белки

2.2. Неструктурные белки ротавируса

2.3. Геном

3. Разнообразие СР типов ротавирусов

3.1. вР типы ротавируса человека и их распределение в мире.

3.2. Механизмы изменчивости и возникновения новых вР типов ротавирусов.

3.3. Разработка ротавирусной вакцины
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Исследуемые объекты
2. Иммуноферментный анализ
3. Электронная микроскопия
4. Электрофоретипироваиие РНК ротавирусов в ПААГ
5. Обратная транскрипцияполимеразная цепная реакция
6. в и Ргенотипирование ротавирусов с использованием ПЦР
7. Определение нуклеотидной последовательности гена энтеротоксина НБР4.
8. Статистический анализ результатов
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Разработка методологии Ргенотипирования ротавирусов
1.1. Оптимизация метода ОТПЦР для выявления РНК гена УР4 и
оценка его эффективности.
1.2. Оптимизация метода ОТПЦР для Р генотипирования
ротавирусов.
2. Особенности циркуляции ротавирусов разных типов в Нижегородской области в гг
2.1. Электрофоретипирование РНК ротавирусов.
2.2. и Р генотипирование природных изолятов ротавируса и анализ их распределения
2.3. Определение субтипа ротавирусов Р8 генотипа
2.3.1. Разработка методики субтипирования аллелей гена V4 генотипа Р8
2.3.2. Анализ смены субгенотипа в процессе многолетней циркуляции ротавирусов 1 Р8 типа
2.3.3. Клинические проявления РВГЭ, вызванного ротавирусом типа 18 2
3. Молскулярно биологическая характеристика ротавирусов, выделенных от новорожденных детей
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
VI. ВЫВОДЫ
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. аминокислотные остатки
дИТФ дезоксинуклсозидтрифосфаты
ден додецилсульфат натрия
кДНК комплементарная ДНК
КРС крупный рогатый скот
НТР нетранслируемый регион
н.о. нуклеотидные основания
ОКИ острая кишечная инфекция
ОТ обратная транскрипция
ПААГ полиакриламидный гель
п.н. пара нуклеотидов
ПЦР полимеразная цепная реакция
РВГЭ ротавирусный гастроэнтерит
РВ ротавирусы
РВИ ротавирусная инфекция
РВЧ ротавирус человека
РНК рибонуклеиновая кислота
ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия
ЭПР эндоплазматический ретикулюм
ЭФ электрофорез
I. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


К середине х годов XX века было установлено, что доля ротавирусного гастроэнтерита РВГЭ может составлять диарейных заболеваний , 0. В более поздних исследованиях с применением метода ОТПЦР было установлено, что частота обнаружения РВ у детей с диареями может достигать , 0. Ежегодно в мире ротавирусная инфекция РВИ диагностируется у 0 млн. В развивающихся странах РВИ часто заканчивается смертью. Смертность от этой инфекции составляет смертей от всех диарейных заболеваний и 6 всех смертей среди детей в возрасте до 5 лет. В развитых странах РВИ является причиной 8 диарей среди населения в целом, амбулаторных посещений, госпитализаций среди маленьких детей . По последним данным ежегодно в мире регистрируется 1 млн. В США ежегодно регистрируется 23 млн. РВИ, тыс. Экономический ущерб от РВИ в США составляет 1,52,0 млрд. Среди детей до 5 лет в США регистрируется госпитализаций на 0 3,5 на детей 2. В Швеции среди детей до 4х лет наблюдается РВассоциированных госпитализаций в год 3,7 на детей . Оценка значимости РВИ в инфекционной патологии детей до 5 лет в Азиатских странах показала, что там ежегодно умирает 1 тыс. Медицинские затраты при этом составляют примерно 1 млн долларов США 0. В России регистрируемая заболеваемость РВГЭ детей сопоставима в последние годы несколько выше с заболеваемостью дизентерией и сальмонеллезом. По данным Федерального статистического наблюдения в России среди детей в возрасте до лет ежегодно регистрируется ,6,5 тыс. Это по всей вероятности связано с качеством диагностики. Высокая ежегодная смертность от РВИ детей в развивающихся странах и высокий уровень заболеваемости детей в развитых странах определили необходимость разработки РВвакцины и других средств иммунопрофилактики. Начиная с года, ВОЗ координирует усилия, направленные на разработку универсальной ротавирусной вакцины, создание которой осложняется высоким уровнем изменчивости РВ и существованием множества их антигенных типов 3. Т, равным . При электронной микроскопии ротавирион напоминает колесо с короткими спицами и хорошо различимым ободом, что послужило основанием для названия вируса от лат. На колесо, которое было предложено Р1е Н Т. II. Вирион сформирован тремя концентрическими слоями белка, которые окружают геном. При электронной микроскопии различают три типа вирусных частиц гладкие двукапсидные ,5 нм, шероховатые однокапсидные нм и сердцевины нм, что отражает существование трех структурных элементов вириона наружного, внутреннего капсидов и сердцевины , . В современном представлении полные вирионы называют трехслойными частицами ТЬР, частицы без наружного слоя называют двухслойными частицами ЭЬР и неинфекционные частицы, у которых отсутствуют два внешних слоя, называют однослойными 8ЬР . Структурная организация ротавириона показана на рисунке 1. Отличительной особенностью структуры ротавириона является наличие 2х каналов трех типов, которые пронизывают наружный и внутренний капсиды, достигая сердцевины. Каналы различаются своим положением и размером. Двенадцать каналов 1го типа и шестьдесят каналов Нго типа имеют размер входного отверстия А и располагаются вдоль икосаэдральных осей пятого и шестого порядка, соответственно. По краю каналов Нго типа расположены двулопастные выступы наружного капсида, которые возвышаются над поверхностью на нм. Шестьдесят каналов Шго типа имеют глубину 0 А и ширину А. При входе в частицу эти каналы сужаются, а затем максимально расширяются, приближаясь к поверхности внутренней оболочки. На поверхности оболочки сердцевины имеются поры, которые соединены с каналами Шго типа во внутреннем капсиде вириона. Считают, что каналы вовлечены в импортирование метаболитов для транскрипции рибонуклеиновой кислоты и экспорта синтезированных РНКтранскриптов, для дальнейшего процесса вирусной репликации , 8. Наружный капсид ротавириона сформирован двумя белками гликопротеином УР7 и протеазочувствитсльным УР4 и представляет собой сотоподобную решетку. УР4 белок, кодируемый четвертым геномным сегментом РНК, имеет м. Да и состоит из 6 а.